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对HER2 low乳腺癌患者来说，和传统化疗方案相比，德曲妥珠单抗(Trastuzumab deruxtecan，T-DXd)显著提高了患者的无进展期（PFS）和总生存期（OS），为HER2 low乳腺癌患者治疗打开了新的篇章(1)。然而，因传统的免疫组化旨在定性区分HER2扩增和未扩增，无法对HER2 low进一步分层，区分HER2 0和HER2 low的能力受到质疑，使得一些HER2 low的乳腺癌患者可能无法从新的抗HER2治疗T-DXd中受益。 在乳腺癌中，10-20%为HER2阳性，80-90%为HER2低表达或阴性(2, 3)，其中HER2低表达人群数量庞大占总人群的45%-55%(2)。2022年2月3日，JAMA oncology上发表了美国病理医师学院对2019～2020年全球1391～1452个实验室HER2 IHC检测问卷调查数据和耶鲁大学18位病理医师对170份乳腺癌活检标本读片一致性研究的分析数据(4)，结果显示一致率≥90%的多为0或3 （52例），而判读不一致的样本主要集中在0和1 的区分（15例），IHC 0和1 一致率仅有26%，而2 和3 的一致率为58%。 DESTINY-Breast04研究评估了地方实验室的和中心实验的HER2 IHC结果样本之间的一致性，研究结果发现,地方实验室认定为HER2 low的样本，经中心实验室采用PATHWAY HER2 4B5检测法（适用时采用INFORM HER2 双FISH DNA 探针混合液）检测同样确认为HER2 low的比例为78%(823/1060)。在22%(237/1060)的不一致样本中，89%样本（208/237)中心实验室评分IHC 0，12%(29/237) 样本中心实验室评分为IHC 2 /FISH 或IHC 3 ，地方实验室和中心实验室对HER2 low的检测结果只有中等一致性。 从上述研究结果可以看出在临床实践中精准的区分IHC 0/1 仍存在着较大挑战。因此，需要更定量、客观的实验室方法来量化乳腺癌的HER2表达，特别是传统的“HER2阴性”。从175例病理诊断为HER2 0的乳腺癌标本中获得富含肿瘤细胞的组织，设定相对强度单位(RU)并作为内部校准曲线和由已知HER2阳性（IHC 2 /FISH 或IHC 3 ）、HER2 low和HER2 0表达肿瘤组成的参考物，基于RPPA的定量HER2蛋白表达被分成“零/极低”、“较少”、“中等”和“高”四种类型（图1）。研究结果发现：使用化学发光免疫分析（CLIA）定量LCM-RPPA的HER2蛋白表达时，并不能准确定量分析IHC HER2 0的蛋白的表达。其中40%的ER IHC 0和30%的ER-
IHC 0 BC病例实际上表达了中等数量的HER2，这与DAISY试验中HER2 IHC 0患者T-DXd治疗30%的应答率接近。 Myrto Moutaf研究团队(5)为了确定乳腺癌中未扩增 HER2检测的最佳动态范围，重新设计了一种测定法，以提高测定法的分辨率，从而对未扩增病例中的 HER2表达进行分层。该研究使用定量免疫荧光的AQUA™方法来测试一系列抗体浓度，以最大限度地提高HER2表达较低范围内的灵敏度。然后，使用细胞系微阵列，通过质谱法测量HER2蛋白，作者确定了HER2蛋白的单位数量attomols/mm2， 然后通过计算该测定的检测限、定量限（LOQ）和线性度（LOL），最终作者确定未扩增细胞系中的低HER2表达范围在2到20
attomol/mm2之间。 作者将该测定法应用于耶鲁大学364例乳腺癌病例中，结果发现有17%的病例(61/364)低于LOQ,
16%（58/264）高于LOL，大多数病例(67%)在检测的线性范围内。DAISY试验中HER2 low患者对T-DXd的治疗有应答，但药物疗效的阈值尚未确定。为了证明该方法的临床应用，有必要对检测到的HER2靶向T-DXd治疗有临床反应的样本进行回顾性定量分析，然后进行前瞻性临床试验。图3：364名乳腺癌患者的HER2 low含量直方图（amol/mm2） 新的抗HER2治疗在一些既没有HER2蛋白过度表达又没有HER2基因扩增的患者中显示出获益，研究(6, 7)表明，使用多反应监测质谱(MRM-MS)量化从福尔马林固定石蜡包封(FFPE)乳腺癌组织中提取的HER2蛋白的可行性，MRM结果与IHC/ISH之间具有高度一致性。同时也证明基于MRM测量和抗HER2治疗的临床反应的相关性(8)。这些研究在不富集的情况下检测了HER2的表达，较多的HER2 low肿瘤的HER2表达水平低于定量限(LOQ)的下限，需要大量输入才能更精准的定量检测HER2表达水平。为解决这一问题，Jacob J. Kennedy,a等人(9)测试了一种基于靶向质谱的测定HER2蛋白在福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)和冷冻乳腺癌活检中可行性，采用免疫亲和富集-多反应监测-质谱联用（Immuno-MRM-MS）对96例冰冻和119例FFPE 乳腺癌活检标本中的HER2蛋白进行了定量分析。结果表明，Immuno-MRM-MS可用于FFPE和冷冻乳腺癌活检组织中HER2的定量分析，即使在HER2表达水平较低的情况下也是如此。图4
Immuno-MRM-MS工作流程量化乳腺癌组织样本中的靶点图5 Immuno-MRM-MS测量可以区分FFPE和冷冻肿瘤活检中的HER2状态 人工智能（AI）通过机器学习免疫组化图片，识别肿瘤细胞；通过学习肿瘤细胞的染色模式，测定染色强度、细胞膜完整性和阳性占比来分析肿瘤细胞中HER2表达水平，用来辅助HER2结果判读。
图6：对比人工判读大致估算阳性细胞占比；AI辅助判读能够给出精确的各类染色模式细胞比例2022
SABCS会议公布了多项HER2
low病理检测相关前沿技术与AI判读相关研究。研究报告基于AI的全自动乳腺癌HER2评分解决方案的成功开发和独立验证，该算法在HER2组织切片中展现出非常高的检测浸润性癌症的性能，AUC为0.967，且与GT(标签真实值)相比，在HER2评分上总体准确率为80.3%（10） HER2 Low乳腺癌中HER2
mRNA的表达情况
考虑到基因扩增、RNA转录和蛋白表达之间的直接联系，mRNA的测量可能被用于更多的可复制的定量分析。有研究表明（11），在雌激素受体（ER）阳性乳腺癌中，IHC的HER2 0和HER2 1 /2 之间HER2 mRNA表达有中位数的差异，但值的范围有很大的重叠。但该研究中，观察ER阴性乳腺癌中HER2 mRNA的表达水平时，这些差异几乎消失了，所以差异可能与亚型相关。浙江大学医学院附属第一医院滕晓东教授团队在2022 EBCC会议（12）上报道了HER2 low乳腺癌中HER2 mRNA的表达。该研究采用MammaTyper®实时定量聚合酶链反应( qRT-PCR)试剂盒检测由3名病理学家经IHC/FISH证实HER2阴性的乳腺癌手术标本中的HER2 mRNA水平。通过类间相关系数(ICC)分析3名病理学家之间HER2 IHC评分的病理学家间的一致性，并与MammaTyper®结果进行比较。图7：IHC/FISH HER2阴性FFPE BC样本HER2 mRNA的分布 在该研究的177例病例中，三名病理学家评估HER2 0 和HER2 low的ICC值为0.934。3名病理医师独立诊断为HER2 0(“IHC HER2 0组”)42例，HER2 low(“IHC HER2 low组”)115例，IHC评分缺乏一致性(“IHC不一致组”)20例。MammaTyper®在IHC
HER2 low组的HER2 mRNA平均表达水平高于IHC
HER2 0组(38.7±1.28 vs 37.91±1.34 [adj. p < 0.01])和IHC不一致组(38.7±1.28 vs 37.66±2.16 [adj. p <
0.01])。值得注意的是，MammaTyper®在IHC不一致组的IHC HER2 mRNA表达水平平均值甚至低于IHC HER2 0组(37.66±2.16 vs 37.91±1.34 [aj .p = 0.78]，图7A)；这提示IHC不能准确区分HER2 low 。作者由此认为与IHC/FISH相比，mammyper®qRT-PCR检测方法是一种有希望通过准确检测HER2表达来定义HER2 low乳腺癌的替代方法。上述各种针对HER2 low 乳腺癌患者诊断技术目前属于实验阶段，仍需大量的数据及实验去证实临床应用的可行性。最终的目的是为了减少病理诊断医生对HER2 low患者的遗漏，让更多的HER2 low 乳腺癌患者走向更久生存。滕晓东 主任医师 浙江大学医学院附属第一医院中华医学会病理学分会常委 CSCO肿瘤病理专家委员会常委 吴阶平医学基金会病理学部副主任委员 浙江省医学会病理学分会主任委员 浙江省医师协会病理科医师分会会长 浙江省抗癌协会肿瘤靶向及细胞治疗专委会副主任委员 卫健委病理质控专家委员会委员
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