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每次大分子检测都测不到条带，好伤心！ 每次检测要么没有条带，要么条带偏小，Why？ 大分子WB检测实在是太难了！ 最近，Proteintech技术支持收到了不少客户关于大分子WB检测的咨询，由此可见大分子检测可谓是难倒一大批做WB的科研人员！ 那么作为一家专业的抗体生产商，针对大分子抗体，500kD以上的超大分子，Proteintech又是如何检测的呢？
秉承着“助力科研”的理念和愿景，小P带着《Proteintech大分子WB疑难解析和检测方案》来啦~ 做大分子WB检测，我们首先得弄明白：大分子WB的难点在哪里？只有弄清楚了难点在哪里，我们才能做出相应的对策。 那到底难在哪里呢？难点就在：大分子蛋白质的完整性容易被破坏。 那如何去保护大分子蛋白质的完整性不被破坏呢？我们可以从两个方面去改进：凝胶体系和蛋白样品制备。 （1）凝胶体系 我们目前使用的WB以Laemmli凝胶体系为主，Laemmli凝胶体系的优点我们就不必过多说明，关键是它的缺点大家是否了解？ （a）Laemmli凝胶的分离胶高pH值（8.8）,易造成蛋白质碱性降解，如脱氨基作用等；（b）在Laemmli凝胶体系中含有半胱氨酸的蛋白质的氧化还原状态并不稳定；（c）Laemmli凝胶体系的制样过程中加入SDS sample buffer后，100℃煮样会造成ASP-Pro键断裂①。 由此可见Laemmli凝胶体系对大分子蛋白质完整性的保护是“极不友好”的，所以凝胶体系需要改变。 那到底哪种凝胶体系更加适合大分子WB检测呢？ 其实早在十几年前，免疫学的科学家们就提出了Tris-Acetate凝胶体系用于大分子WB的检测，Tris-Acetate凝胶体系的中性pH值（7.0）完美的避开上述Laemmli凝胶体系的缺点，最大程度的保持大分子蛋白质的完整性。 为了验证Tris-Acetate凝胶体系的可靠性，严谨的Proteintech科研人员做了各种实验对比，结果如下图：
通过上述实验结果，可以很清晰地看到，Hela样品在Tris-glycine凝胶中150KDa以上的条带很少且模糊，尤其是250KDa以上基本看不到任何条带；而反观Tris-Acetate凝胶中150KDa以上的条带非常的清晰、锐利。 （2）蛋白样品制备 选择了合适的凝胶体系，接下来的关键步骤就在蛋白样品制备上了。裂解液的裂解强度对大分子蛋白质的完整性起到决定的作用，我们可以通过一张跑胶图片来分析：  上图中是使用三种不同裂解强度的裂解液分别制备的mouse skeletal muscle的总蛋白样品，裂解液强度依次为Lane1（很强） >Lane2（中等）>Lane3（温和）。 我们仔细观察100KDa以上的蛋白条带可以发现在一定范围内裂解液的强度越温和时，100KDa以上的大分子蛋白条带会更多、更清晰。这是为什么呢？ 可能存在的原因有：（1）当裂解液越强时，对蛋白质的溶解能力就越强，含量高的蛋白质溶解的就越多，后续对蛋白样品进行定量后，点样相同量的总蛋白时含量低的大分子蛋白质上样量就更低了；（2）当裂解液强时，大分子蛋白质容易被解聚，从而导致条带少。 为了避免大分子蛋白质的完整性在样品制备环节中被破坏，我们可以做以下三点改变： （1）使用裂解能力温和的裂解液。如RIPA裂解液（中）、RIPA裂解液（弱）、Co-IP裂解液等，对于500KDa以上的大分子蛋白质检测甚至可以使用比上述裂解液更温和的CHAPS裂解液（配方见下文）。当然需要引起我们注意的是裂解液越温和溶解性越差，我们需要结合待测靶蛋白选用合适的裂解液。 （2）使用LDS-PAGE蛋白上样缓冲液。相比于的SDS，LDS不仅具有SDS相同的变性能力，还更加利于维持蛋白质的完整性。 （3）70℃水浴10分钟代替100℃煮样5分钟。70℃水浴可以有效的避免蛋白质ASP-Pro键断裂。 注：以上提供的只是大分子蛋白样品制备的最佳方案，并非常规SDS-PAGE蛋白上样缓冲液制样方式就一定不能用于大分子检测。 一、样品制备 1. 根据下图配制CHAPS裂解液和LDS-PAGE蛋白上样缓冲液（4X）。
2. 细胞样品处理 a、瓶内裂解法（效果最佳）：适用于所有的贴壁细胞 吸净培养基，用预冷的PBS清洗细胞表面2遍（动作轻柔，防止细胞脱落），尽可能吸取残留的PBS。在冰上按每1000万细胞加入1mL预冷的CHAPS裂解液于细胞瓶、培养板或培养皿中，用移液管吹散贴壁的细胞，对于贴壁紧的细胞也可使用细胞刮收集，收集裂解液，4℃冰箱或冰盒中摇晃30分钟，使其充分裂解。 b、离心法：适用于悬浮细胞和药物处理过的细胞 使用细胞刮收集细胞悬液（连同培养基一起收集），4℃，500 xg离心5分钟，收集沉淀，沉淀用预冷的PBS洗涤两遍，收集细胞沉淀，尽可能吸取残留的PBS。按每1000万细胞加入1mL预冷的CHAPS裂解液，4℃冰箱或冰盒中摇晃30分钟。 3. 动物组织样品： 取新鲜的动物组织，用预冷的PBS洗净组织块上附着的脂肪和血液等杂质，用滤纸吸干水分后称重。在离心管中将组织块剪碎，然后在冰上，按每100mg组织加1mL预冷的CHAPS裂解液。将样品转移到合适大小的预冷玻璃匀浆器中，在冰浴条件下对样品匀浆10-20次至充分裂解，收集匀浆液，4℃冰箱或冰盒中摇晃30分钟，使其充分裂解。 4. 4℃,15000xg离心15分钟，收集上清样品。 5. 使用BCA蛋白浓度检测试剂盒检测蛋白浓度，将样品分装成小份，同时每管按3:1加入LDS-PAGE蛋白上样缓冲液（4X），使样品中LDS-PAGE蛋白上样缓冲液的终浓度为1X，上下颠倒混匀，保存在-80℃冰箱。 6. 使用前室温解冻，每管补加新鲜的2M DTT溶液至终浓度为100mM，混匀，70℃水浴10分钟。 注：（1）不要对样品进行超声破碎；（2）解冻后的样品在2个小时内使用完；（3）样品不要反复冻融。 二、制梯度胶 （1）根据下图配制3M Gel buffer(15X)和40%Gel(37.5:1)。
（2）按配方配制两种不同浓度的Tris-Acetate胶，使用梯度胶灌胶器先灌20mL 3%低浓度的Tris-Acetate胶，然后再将剩余的两种不同浓度的Tris-Acetate胶加入相应的梯度混匀仪杯体中，打开梯度混匀仪杯体的连通阀门开关进行梯度胶灌制，灌至小玻璃上边缘结束灌入，并插入梳子。 （3）室温水平静置2小时，直至醋酸胶完全凝固即可拔出梳子进行跑胶。 Tips： （1）常用的Tris-glycine胶体系所用的胶母液C%值通常为3，而用于大分子检测的Tris-Acetate胶的胶母液C%值可以适当的降到2.6，这样可以让大分子的蛋白质完全进入凝胶中，避免堵塞在进样口。C%=Bisacrycrylamide/(Bisacrycrylamide Acrycrylamide)*100% （2）为让大分子蛋白完全进入凝胶，我们先灌制了2.5-3cm的3%的胶，然后再灌梯度胶。 （3）APS和TEMED应在浇注凝胶之前最后加入。APS溶液应新鲜制备，以确保凝胶具有良好的分辨率。 三、跑胶 1. 根据下图配制1X Running buffer。
2. 将梯度胶玻璃板上的残胶冲洗干净，放置在电泳槽中，加入1×Running buffer，将整个电泳槽放入冰水浴中,将标准品和蛋白样品加入胶的点样孔中，使用130v电压电泳，直至蓝色指示线跑出胶后结束电泳。 Tips： 3-8%的Tris-Acetate梯度胶在冰水浴中使用130v电压电泳通常90分钟指示剂可以完全跑出胶，此时凝胶最下面的Marker为50KDa左右，如需检测200KDa以上的目的带，可以在指示剂完全跑出胶后接着电泳30分钟（即总电泳时长2h），这样最下面的Marker为90KDa左右,200KDa以上的大分子蛋白质会拉的更开。 四、转膜 1. 根据下图配制1X Transfer buffer。
2. 将胶从电泳槽中取出，浸泡在转移缓冲液中，以海绵/滤纸/膜/胶/滤纸/海绵的方式，将其紧密排列，确保各个夹层之间没有气泡，采用20V恒压进行湿法转移过夜，保持整个转移仪在冰水浴中。 Tips： 转膜时不要将凝胶的上部分切掉，因为凝胶的上部分会有分子量较大的蛋白；强烈推荐过夜转移，过夜转移效率最佳。 五、免疫印迹 转移完成后，将膜取出，使用封闭液在37℃水平恒温摇床中封闭1小时，即可用于后续的免疫印迹实验，后续的免疫印迹实验与常规Laemmli凝胶体系步骤相同。 好啦，以上就是今天要和大家分享的全部内容~ 一口气看完的小伙伴们有没有？希望看完此篇后，大分子WB检测将不再成为你们的“痛点”！预祝大家实验成功~ |
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