STTT（IF=38.104）：郑州大学董子钢团队发现中药小分子毛兰素的直接靶点

天然产物是药物发现的宝贵资源，挖掘他们在不同疾病中的疗效并阐明其作用靶点和作用机制，对扩大其临床适应症、开展结构优化和进一步研发至关重要。郑州大学董子钢教授是癌症预防领域的知名科学家，开创性地研究了多种癌症化学预防药物的分子靶点及作用机理，其中包括不少天然产物，发表过多篇高水平药靶相关文章，简要汇总如下：

1）2023年4月，该团队在J Exp Clin Cancer Res（IF=12.658）发表题为“Toosendanin targeting eEF2 impedes Topoisomerase I & II protein translation to suppress esophageal squamous cell carcinoma growth”的文章，揭示川楝素可以与靶向结合真核生物翻译延伸因子2（eEF2），调节下游拓扑异构酶II（TOP1）和拓扑异构酶II（TOP2）的生物合成来抑制食管鳞状细胞癌生长。

2）2023年3月，该团队在Signal Transduct Target Ther（IF=38.104）发表题为“Erianin suppresses constitutive activation of MAPK signaling pathway by inhibition of CRAF and MEK1/2”的文章，揭示毛兰素是一种新型CRAF和MEK1/2激酶抑制剂，从而抑制由BRAF V600E或RAS突变诱导的MAPK信号通路的组成型激活，为BRAF V600E或RAS突变黑色素瘤和结直肠癌提供了一种有前途的先导化合物。

3）2022年10月，该团队在Molecular cancer（IF=41.444）发表题为“Costunolide is a dual inhibitor of MEK1 and AKT1/2 that overcomes osimertinib resistance in lung cancer”的文章，借助超级计算机模拟发现了一种新型的MEK1和AKT1/2抑制剂木香烃内酯，能够抑制MEK/ERK和AKT/GSK3b信号通路进而抑制奥西替尼耐药。

4）2022年10月，该团队在Signal Transduct Target Ther（IF=38.104）发表题为“Acetylshikonin inhibits inflammatory responses and Papain-like protease activity in murine model of COVID-19”的文章，揭示乙酰紫草素不但可以结合并抑制SARS-CoV-2 PL-pro的蛋白酶水解作用起到抗病毒效果，同时能够拮抗干扰素通路起到抗炎效果，针对新冠病毒引起的肺炎起到了标本兼治的作用。

5） 2022年10月，该团队在Acta Pharm Sin B（IF=14.903）发表题为“Novel dual inhibitor for targeting PIM1 and FGFR1 kinases inhibits colorectal cancer growth in vitro and patient-derived xenografts in vivo”的文章，揭示靶向PIM1和FGFR1激酶的新型双重抑制剂HCI-48（查尔酮的衍生物）能够靶向PIM1（丝氨酸/苏氨酸激酶家族）和FGFR1（成纤维细胞生长因子受体，一种酪氨酸激酶），从而在体外和体内对结直肠癌的生长产生抗肿瘤作用。

6）2021年3月，该团队在J Exp Clin Cancer Res（IF=12.658）发表题为“Cirsiliol targets tyrosine kinase 2 to inhibit esophageal squamous cell carcinoma growth in vitro and in vivo”的文章，揭示线蓟素可以与TYK2（酪氨酸激酶2）结合并抑制其活性，从而减少STAT3的二聚体形成和细胞核定位，在体外和体内抑制食管鳞状细胞癌的生长。

在此对该团队近日发表在Signal Transduct Target Ther（IF=38.104）上的这篇毛兰素的直接靶点文章进行解析，以供参考。

Ras-RAF-MEK-ERK信号通路（MAPK通路）的组成型激活在许多携带RAS或RAF致癌突变的癌症中频繁发生。66%的皮肤黑色素瘤和25%的结肠癌存在BRAF V600E突变。由于单次使用BRAF或MEK抑制剂引起矛盾性激活（BRAF抑制剂一方面对突变型的BRAF起到抑制作用，另一方面却可以激活野生型的BRAF促进二聚作用，进而激活正常组织中的MAPK通路导致严重毒性作用），在MAPK通路上同时靶向CRAF和MEK被认为是一种有前途的策略。

01发现毛兰素是CRAF和MEK1/2抑制剂

为了发现多激酶抑制剂，研究先前通过表型实验筛选了4种天然化合物（结构如图1A），发现毛兰素表现出强大的抗肿瘤作用。用这4种化合物开展Kinase Profiler™酶谱分析后，发现毛兰素显著抑制CRAF和MEK2的激酶活性（图1B）。

图1发现毛兰素是CRAF和MEK1/2抑制剂

02验证毛兰素直接靶向CRAF和MEK1/2
在确定毛兰素抑制CRAF和MEK2的激酶活性（图2A）以后，为了验证毛兰素直接结合CRAF和MEK2蛋白质靶标，研究采用Pulldown+WB（图2B、C）实验，将毛兰素与Sepharose 4B珠缀合，加入到细胞裂解液和重组CRAF、MEK1/2蛋白溶液，下拉结果显示CRAF和MEK1/2 结合，但不与其他MAPK信号成员结合，例如EGFR和ERK1/2。进一步通过ITC（图2D）和SPR（图2E）均一致表明毛兰素和靶标（MEK1/2或CRAF）之间具有很强的亲和力。接着通过分子对接（图2F）表明毛兰素与CRAF Lys375、MEK1 Lys97和Met146、MEK2 Lys101和Met150形成氢键。为了进一步确认对接结果，通过分子动力学模拟预测毛兰素与MEK1/2和CRAF结合的模式，发现毛兰素还与MEK2或CRAF形成广泛的疏水和氢键相互作用，所有这些相互作用都有利于稳定结合复合物。为了确认计算对接和分子动力学模拟结果，构建了位点突变的MEK1/2或CRAF蛋白，开展CETSA（图2G）和Pulldown+WB（2H）分析，发现毛兰素可分别与MEK1/2 或CRAF结合，而MEK1 K97A/M146A、MEK2 K101A/M150A或CRAF K375A突变破坏了毛兰素与MEK1/2或CRAF之间的物理相互作用。总之，毛兰素是CRAF和MEK1/2的潜在抑制剂。

                图2 验证毛兰素直接靶向CRAF和MEK1/2

最后通过一系列实验发现：

1）新的CRAF和MEK1/2激酶双重抑制剂毛兰素能够抑制BRAF V600E 或RAS突变诱导的MAPK信号通路的组成型激活；

2）毛兰素通过同时靶向CRAF和MEK1/2在体内和体外抑制BRAF V600E或RAS突变黑色素瘤和结直肠癌的生长。

总结与讨论

该研究通过基于表型的天然产物化合物筛选确定了天然产物毛兰素能够抑制肿瘤细胞生长，进一步通过激酶筛选实验发现毛兰素能够显著抑制CRAF和MEK2的激酶活性，接着通过Pulldown、ITC、 SPR、CETSA、分子对接等一系列靶点结合实验验证了毛兰素与CRAF和MEK2的直接结合，最后通过细胞和动物实验发现毛兰素作为新的CRAF和MEK1/2激酶双重抑制剂，能够抑制BRAF V600E 或RAS突变诱导的MAPK信号通路的组成型激活，在体内和体外抑制BRAF V600E或RAS突变黑色素瘤和结直肠癌的生长。该研究为BRAF V600E或RAS突变型黑素瘤和结直肠癌提供了一个有前景的先导化合物。

相关文献

Wang P, Jia X, Lu B, et al. Erianin suppresses constitutive activation of MAPK signaling pathway by inhibition of CRAF and MEK1/2. Signal Transduct Target Ther. 2023 Mar 6;8(1):96.