【原】分子克隆｜第5期. 质粒构建是否成功你知道怎么验证吗？

一、基因水平

1. 通过qPCR从基因表达水平进行验证

基因表达验证需要经历以下几个主要流程：

① 细胞RNA提取

② RNA浓度，纯度测定

③ RNA反转录即RNA反转录成cDNA

最好在RNA提取当天直接进行反转录，不要反复冻融RNA，会导致RNA降解，尤其是纯度不高的RNA更容易降解。

④ qPCR检测基因表达水平

由于qPCR需要以内参基因作为对照来分析基因表达，因此选择合适的内参基因非常重要。常用的内参有18s RNA、β-actin、Gapdh、α-tubulin和β-tubulin，为了确保实实验数据可用，建议大家每次选用两个内参基因。

⑤ qPCR数据分析

二、蛋白水平

1. Western blot验证蛋白是否表达成功

如果研究的目的蛋白没有合适的抗体，可选择构建带标签的融合蛋白，通过检测标签蛋白的表达明确目的蛋白是否表达成功。

2. 通过免疫荧光染色验证蛋白表达

通过以上三种验证方式我们就可以明确自己的质粒是否构建成功。如果是构建成功的质粒即可进入后续的表型和机制验证环节。