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背景介绍： mNGS即宏基因组二代测序，这种检测方法不需要额外培养微生物，直接从环境/临床样品中提取得到全部微生物的DNA，利用二代测序的方法研究样本中全部微生物的遗传组成及其群落功能，相比培养微生物，克快速获得分析报告。 近年来mNGS关注度极高，医院和第三方医学检验公司也开始开展相关项目，但针对类疑难样本的处理没有标准的方案，今天介绍两篇文献详细介绍了整体实验方案，包括所需样本体积、样本采集运输保存、上清分离、核酸提取、建库等，其中样本核酸提取和建库分别采用了QIAamp DNA Micro Kit和QIAseq Ultralow Input Library Kit两款来自QIAGEN的明星产品。 mNGS用于诊断儿童神经系统感染 为了评估儿童脑脊液中游离DNA（cfDNA）mNGS的性能，本文章分析了cfDNA mNGS在中枢神经系统感染或非感染性神经疾病儿童中的效率。采用124名随机受试者的脑脊液样本，评价cfDNA的mNGS与全细胞DNA（wcDNA）之间的准确性。 样本类型：脑脊液 流程：每个受试者采集约1-2 mL的脑脊液，在提取cfDNA时，将脑脊液样品中的细胞通过1600g离心10 min去除，然后在4°C下以16000g离心10 min。从上清液中提取并纯化cfDNA。在提取wcDNA时，使用研磨仪对脑脊液样本均质化，然后，将处理后的标本在10000g下离心5 min，二者均使用QIAamp DNA micro Kit（56304）进行纯化。 使用Qubit 检测核酸的质量，宏基因组学文库由QIAseq Ultralow Input Library Kit（180497），仅需最低10pg的起始DNA。文库质量由安捷伦2100生物分析仪进行监测，在Illumina Nextseq 550平台上进行汇集和测序。 结果：cfDNA mNGS检测到的微生物广泛检出率为71.0%，与临床诊断的敏感性和总符合率分别为68.9%和67.5%。与wcDNA mNGS相比，cfDNA mNGS在检测病毒（66对13）和分枝杆菌（7对1）方面具有更高的效果，且reads显著高于每百万分。mNGS试验的最佳时间为抗感染治疗开始后1~6天，mNGS开始较早，细菌中枢神经系统感染的识别越好。 结论：cfDNA mNGS在儿童中枢神经系统感染的致病病原体检测方面总体上优于传统方法，甚至优于wcDNA mNGS。 mNGS用于诊断尿路感染 尿路感染（UTI）是最常见的感染之一，病原体培养是诊断UTI的金标准，然而培养耗时且检出率较低。本文章的研究者们在临床中发现，有些患者在尿液病原体培养结果为阴性，但他们有多次异常的尿检结果和持续的尿路症状，并仍被怀疑患有UTI。故而将mNGS检测技术应用于UTI，并与常规实验室检测进行比较，并评估患者的临床结果。 样本类型：尿液 流程：3ml尿液用于mNGS检查，使用干冰保存，24h内运送至实验室，离心去除样品中的细胞，收集上清后提取DNA。使用QIAamp DNA micro Kit（56304）进行纯化核酸。使用Qubit 检测核酸的质量，宏基因组学文库由QIAseq Ultralow Input Library Kit（180497），仅需最低10pg的起始DNA。文库质量由安捷伦2100生物分析仪进行监测，在Illumina Nextseq 550平台上进行汇集和测序。 结果：在尿液样本的细菌和真菌检测中，在29例mNGS（87.9%）中至少检测到一种病原体，其中19例（57.6%）mNGS阳性但尿液微生物培养阴性，10例（30.3%）mNGS和培养阳性。其余4例（12.1%）患者经两种检测均为阴性。总体而言，mNGS的表现优于培养物。此外，mNGS检测到了更广泛的病原体谱，检测到了26种，而在培养中只发现了5种。mNGS敏感性显著高于培养检测。 结论：mNGS是一种比培养有明显优势的技术，特别是在难以诊断和治疗的混合感染和尿路感染的背景下。它有助于提高对病原体的检测，指导治疗策略的改变，是对尿液培养的有效补充。 好物推荐： QIAamp DNA micro Kit（56304） 适合微量样本的DNA纯化，包含体液样本、显微切割样本、活检样本等。 QIAseq Ultralow Input Library Kit（180497） 高效的优化反应体系可兼容最低10pg的起始DNA用于文库的构建； 特别适合微量的片段化样本，如cf-DNA,Chip-Seq，穿刺样本及激光显微切割样本。 阅读原文 doi: 10.3389/fcimb.2023.1119020 doi: 10.1128/spectrum.02530-22 |
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