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假单胞菌环状脂肽medpeptin的生物合成及其调控植物免疫的作用机制 Pseudomonas Cyclic Lipopeptide Medpeptin: Biosynthesis and Modulation of Plant Immunity  Article，2023-7-23，Engineering，[IF 12.8] DOI：https:///10.1016/j.eng.2023.05.016 原文链接：https://www./science/article/pii/S2095809923002746 第一作者：Yi-Lin Gu (谷医林)；Jun-Zhou Li (李俊州) 通讯作者：Hai-Lei Wei (魏海雷) 合作作者：Yan Li (李彦)；Shen Cong (从珅) ；Jing Wang (王静)；Yi-Nan Ma (马毅楠) 主要单位： 中国农业科学院农业资源与农业区划研究所 (State Key Laboratory of Efficient Utilization of Arid and Semi-arid Arable Land in Northern China, Key Laboratory of Microbial Resources Collection and Preservation, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Institute of Agricultural Resources and Regional Planning, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China) 中国农业科学院蔬菜与花卉研究所 (Institute of Vegetables and Flowers, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China) - 摘要 - 环状脂肽（Cyclic lipopeptides，CLPs）是一类由细菌产生的多功能次生代谢产物，也是一类重要的植物免疫激发子。假单胞菌环状脂肽在结构和生物活性上极其复杂和多样化。但是，目前对环状脂肽的结构及其与植物互作中的功能认识仍比较有限。本研究从地中海假单胞菌中鉴定了一种由22个氨基酸组成的新型的环状脂肽medpeptin，该脂肽由一个非核糖体肽合成酶基因簇合成并受群体感应系统调节。进一步研究发现，medpeptin可以诱导植物产生免疫反应，增强植物对病原细菌的抗性，但其自身不具备抗菌活性。利用比较转录组分析和病毒诱导的基因沉默技术解析了参与medpeptin感知植物免疫信号候选关键基因。结果显示，当沉默本氏烟中细胞壁富含亮氨酸的重复延伸蛋白NbLRX3或类受体蛋白激酶NbRLK25后，medpepatin触发的细胞死亡和对病原细菌的抗性受到严重影响，而沉默BAK1或SGT1则并未影响这一表型。本研究结果揭示了一种非典型的CLP感知机制，并为植物抗病免疫研究提供了新的借鉴。 - 引言 - 土壤和植物相关假单胞菌（Pseudomonas）可以通过直接产生拮抗类代谢产物或者间接诱导植物产生抗性等生物学特性来控制植物病害。环状脂肽（Cyclic lipopeptides，CLPs）是一类由多种假单胞菌产生的次级代谢物，因其具有抗菌、细胞毒性和诱导植物抗性等特性引起了人们的极大兴趣。随着越来越多假单胞菌全基因组序列的测定，更加多样化的CLP产物被发现。因此，鉴定新的CLP产物并解析其多重生物学功能，可以为植物病害的生物防治和植物抗病育种提供重要基础。 CLPs是由氨基酸组成的短肽链和与其相连的脂肪酸链组成的，其肽链中两个氨基酸可环化形成内脂环。多数CLPs是由较大的非核糖体肽合成酶（non-ribosomal peptide synthase，NRPS）基因簇负责编码合成的，这些合成酶具有多模块结构，每个模块都参与了脂肽合成过程中氨基酸的修饰和结合。典型的模块可以分为起始和延伸两部分，各部分均包含三个结构域，分别为腺苷酰作用（A）、巯基化作用（T）和缩合结构域（C）。迄今为止，已发现鉴定超过100种假单胞菌CLPs（Ps-CLPs），根据其脂肪酸尾部的组成和长度，氨基酸的种类、数量和构型，将其分为至少14个种类。荧光假单胞菌（P. fluorescens）复合体可以合成 “Mycin”和“Peptin”等两种类型的Ps-CLPs。Mycin家族的环状脂肽含有一个包含9个氨基酸的全环化肽。而peptin家族的环状脂肽是一类分子量较大的CLPs，其含有19-25个氨基酸且部分氨基酸参与环化。CLP的生物合成基因簇（biosynthetic gene clusters，BGCs）通常分布在大于100 kb的基因组岛中。CLP的转运蛋白编码基因位于最后一个合成酶基因的下游，而调控基因如luxR同源基因则位于CLP结构基因的上游或下游。研究表明， P. corrugata编码的N-酰基-高丝氨酸内酯群体感应（N‐acyl‐homoserine lactone quorum sensing，AHL-QS）系统PcoI/PcoR能够调节下游LuxR的表达并控制CLPs的产生和抗菌活性。通过luxR调控CLPs的产生在其他土壤和植物相关假单胞菌中也有报道。 关于CLPs的研究主要集中在抗菌和表面活性剂活性两个方面，然而随着对CLPs功能研究的深入，其作为一类重要植物免疫激发子的功能研究受到了广泛的关注。CLPs与其他微生物衍生的植物免疫激发子一样被称为入侵分子模式（invasion patterns，IPs）。植物进化出细胞表面模式识别受体（cell-surface pattern recognition receptors，PRRs）感知细胞外IPs，如flg22或elf18，进一步激发植物免疫反应（pattern-triggered immunity，PTI），如ROS爆发、胼胝质沉积、丝裂原激活蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）级联和大规模的转录重编程。此外，植物细胞内含有核苷酸结合结构域和富含亮氨酸重复序列的蛋白（nucleotide-binding leucine-rich repeat proteins，NLRs）可以识别胞内的效应蛋白（effector），引起植物产生过敏反应（hypersensitive response，HR）或局部细胞死亡，从而限制病原体增殖。一些研究表明CLPs在多种病理系统中参与激发植物产生抗性。如，P. fluorescens SS101产生的Massetolide A可诱导番茄对疫霉菌（Phytophthora infestans）产生局部和系统抗性。P. protegens及其近缘菌株可以合成orfamide型的CLP，这类CLP不仅具有杀虫活性，而且可以诱导水稻、豆类和卷心菜中等植物对Miyabecochliobolus或Solanrhizoctonia产生抗性。P. corrugata可以合成corpeptin和cormycin两种主要的CLPs，它们都具有抗菌活性，并能诱导烟草细胞死亡、K+/H+交换和活性氧爆发。与其他IPs相比，目前还没有证明表明特异性的PRRs或NLRs直接参与CLPs的感知。然而，值得注意的是，越来越多的研究显示，PRRs在识别细菌的IP（例如脂肪酸或寡肽）过程中承担重要作用。已有研究表明定位于植物表面含有S结构域的凝集素受体激酶（lectin S-domain receptor kinase (LORE/SD1-29）可以感知细菌外膜成分脂多糖并引发先天免疫反应。此外，合成的和分离自细菌脂多糖的medium-chain 3-hydroxy fatty acid（mc-3-OH-FA）代谢物在拟南芥中引起依赖LORE的免疫。最近，Schellenberger等人发现，细菌鼠李糖脂的3-羟基烷酸前体可被LORE感知从而激活拟南芥先天免疫，而鼠李糖脂可以诱导依赖RBOHD的活性氧爆发。此外，一些细胞壁相关蛋白，如富含亮氨酸的重复延伸蛋白（leucine-rich repeat extensions，LRXs），也被证明参与肽识别和免疫调节。因此，我们项探究CLPs是否可以被细胞表面蛋白受体感知来调节植物免疫。 地中海假单胞菌（P. mediterranea）S58是一株植物根际促生细菌，不仅可以拮抗多种植物病原真菌和细菌，也能激发本氏烟自身免疫并诱导细胞死亡。基因组分析表明，菌株S58没有III型分泌系统（type III secretion system，T3SS），但能够产生多个由NPRS基因簇合成的CLPs。本研究中，我们发现NPRS基因簇（BGC7）在激发细胞死亡免疫过程中至关重要，但与抗菌活性无关。利用高效液相色谱和串联质谱技术，鉴定了一种由BGC7合成和侧翼QS系统调控的含有22个氨基酸的新型CLP—medpeptin。通过比较转录组学分析确定了本氏烟中响应medpeptin感知的关键信号基因。病毒诱导的基因沉默（virus-induced gene silencing，VIGS）结果表明，细胞壁富含亮氨酸的延伸蛋白和类受体蛋白激酶在medpeptin和菌株S58引发的细胞死亡免疫过程中至关重要。因此，我们的研究揭示了一种非典型的CLP-植物相互作用机制。这些CLP调控植物免疫的新见解将为植物病害新型防控策略和生物技术的应用提供重要借鉴。 - 结果 - 地中海假单胞菌诱导细胞死亡相关基因的鉴定 Identification of P. mediterranea genes involved in cell death induction 我们前期研究发现地中海假单胞菌S58可以诱导本氏烟细胞死亡免疫[27]。然而，在S58基因组中未发现T3SS同源物，排除了T3SS依赖性细胞死亡的可能性。然后，我们通过正向遗传学技术建立了一个包含14,976个克隆的Tn5转座子插入文库，来筛选不能诱导细胞死亡的突变体。同时筛选拮抗活性丧失或减弱的突变体以确定菌株S58的双元功能。结果发现，12个突变体表现出激发细胞死亡能力或者抗菌活性受到影响。其中，10个突变体对立枯丝核菌和水稻黄单胞菌的拮抗活性显著降低，而3个突变体丧失了诱导本氏烟细胞死亡的能力（图1）。有趣的是，只有Tn5-8在拮抗活性和诱导细胞死亡方面都表现出缺陷。Tn5-6和Tn5-7仅丧失了诱导细胞死亡的能力，但保持了较强的抗菌活性，而其余的则具有相反的作用（图1）。我们鉴定了所有突变体的插入位点，这些突变体与编码天冬氨酸-tRNA连接酶、天冬氨酸转氨酶家族蛋白、非核糖体肽合成酶、酰基-高丝氨酸内酯合成酶和谷氨酰胺合成酶等五个基因相关（见附表S3）。一些突变体被Tn5插入到同一基因的不同位点，例如Tn5-6和Tn5-7，这两个细胞死亡缺陷突变体均在NRPS基因上发生突变（见附表S3）。  图1拮抗和细胞死亡缺陷突变体的筛选。 分别以R. solani和X. oryzae作为植物病原真菌和病原细菌靶标筛选拮抗丧失的突变体。将真菌菌饼置于PDA平板中央，而病原细菌菌液则混入培养基中倒平板，然后分别在平板左右两侧点接菌株S58和不同突变体的发酵液并测量抑菌圈直径。每行第一个处理为单独接种菌株S58的对照。“R”表示与野生型相比，突变体的拮抗活性降低；“—”表示没有影响。通过接种本氏烟叶片筛选细胞坏死缺陷突变体。将浓度为5 × 108 cfu/ml的菌液注射接种到叶片的特定区域，接种2 d后观察并拍照记录叶片变化。每个图片下方对应分数表示相对于试验接种次数观察到的细胞死亡次数。所有试验均设置3次重复且结果一致。 同时，我们使用基因组挖掘和位点特异性突变来鉴定参与拮抗和细胞死亡的基因簇。使用PRISM从地中海假单胞菌S58中预测了9个生物合成基因簇（BGC），如附图S2(a)和表S2所示。通过对基因簇分析，我们发现BGC6、BGC7和BGC8依次连接为基因岛（附图S1(a)）。总体而言，该基因岛与P. mediterranea CFBP 5447、Pseudomonas sp. SH-C52、P. corrugata DSM 7228和P. fluorescens In5中的基因岛同源（附图S1(a))） [11, 47-49]。其中，BGC6包含9个基因，包括一个pcoI/pcoR群体感应系统和一个pcoABC操纵子（图2(a)）；BGC7含有三个NRPS基因，其同源物在相应的假单胞菌菌株中可合成thanapeptin、corpeptin和nunapeptin等3种CLPs，而BGC8的同源物可合成thanamycin、cormycin和nunamycin（附图S1(A)）[21,48,49]。根据前人的命名规则，我们将地中海假单胞菌S58中BGC7和BGC8的潜在CLP产物分别命名为medpeptin和medmycin。相应的，medpeptin和medmycin的NRPS基因分别被命名为mepABC和medAB（图2(a)）。与Tn5突变体的插入位点相比，BGC6覆盖了Tn5-8中中断的pcoI基因，而BGC7覆盖了Tn5-6和Tn5-7中插入的mepC基因(图2(A))。除BGC4和BGC9外，我们在其他7个BGCs中进行了无标记缺失突变，并测试了它们的抗菌和激发细胞死亡的活性。结果表明，S58∆BGC6（缺失pcoABC）和S58∆BGC7（缺失mepABC）不能激发本氏烟的细胞死亡，而只有S58∆BGC6表现出抗菌活性降低（图2(a)）。然后使用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF）测定细菌代谢物谱，以确认BGC突变体代谢物的产生是否受到影响。如图2(b)所示，与野生型菌株S58相比，S58∆BGC6和S58∆BGC7在m/z 2050到m/z 2200之间存在分子缺失。鉴于BGC7负责medpeptin的生成，我们认为medpeptin的质量范围在m/z 2050到m/z 2200之间。  图2. 7个生物合成基因簇（BGCs）突变体的构建与鉴定。 （a）利用PRISM软件进行BGCs预测和二次重组构建突变体。预测的开放阅读框及其方向用箭头表示，其中红色、蓝色、绿色、紫色和灰色箭头分别代表核心生物合成基因、转运相关基因、调控基因、附属的合成基因和其他辅助基因。基因簇下方的双向箭头表示重组插入的位置，虚线表示删除的片段，黑色三角形表示Tn5随机突变体的插入位点。拮抗活性和细胞死亡检测同图1； （b）P. mediterranea S58及其突变体的代谢谱检测。利用MALDI-TOF检测不同菌株发酵上清的萃取物，其中突变体BGC6和BGC7缺失了质荷比从2050 到2200之间的主要分子。 QS正调控地中海假单胞菌BGC7和BGC8的表达、诱导细胞死亡和抗菌活性 QS positively controls the expression of BGC7 and BGC8, cell death elicitation, and antimicrobial activity of P. mediterranea 如图2(a)和(b)所示，我们发现pcoABC操纵子（S58∆BGC6）与本氏烟的medpeptin合成、抗菌活性和细胞死亡相关。为了检验BGC6中的QS系统是否调节BGC7和BGC8的表达，我们构建了一个pcoI突变体。逆转录定量PCR（quantitative reverse transcription polymerase chain reaction，qRT-PCR）结果显示，来自BGC7的mepA、mepB和mepC或来自BGC8的medA和medB的转录表达在pcoI突变体中被抑制（图3(a)）。此外，通过MALDI-TOF检测，S58∆pcoI与pcoABC突变体在m/z 2050到m/z 2200之间表现出相同的分子缺失（图3(b)），表明QS系统正向调节medpeptin的产生。然后，我们研究了QS是否调控地中海假单胞菌介导的细胞死亡和抗菌活性。如图3(c)所示，pcoI突变体未能诱导本氏烟的细胞死亡，并且对植物病原体的拮抗作用明显下降，这与Tn5-8和S58∆BGC6的结果一致（图1和图2(a)）。因为BGC7和BGC8的单突变体与菌株S58相比在抗菌活性上没有差异，我们研究了BGC7和BGC8是否具有冗余性。结果显示，BGC7和BGC8的双突变体S58∆BGC7∆BGC8显示出与菌株S58和单突变体相同的抗菌活性（图3(c) 和图2(A)）。总的来说，我们的研究结果表明地中海假单胞菌S58的所有已知的BGCs都不参与拮抗植物病原菌；QS系统能够控制BGC7表达、medpeptin合成、诱导植物细胞死亡和一种未知的抗菌产物。由于我们的目标是解析细胞死亡诱导剂及其与植物相互作用的机制，因此，本研究我们只关注BGC7及其产物medpeptin。  图3. QS系统调控BGC7和BGC8的表达及菌株S58的生物活性。 （a）pcoI正调控BGC7中mepA、mepB、mepC的表达和BGC8中medA、medB的表达。所有基因的表达水平通过与recA基因进行标准化并以野生型中基因表达情况做归一化处理。相对表达量的计算利用2-ΔΔCt计算公式。所有数据为3次重复的平均值±标准差（**表示P < 0.01）； （b）pcoI基因突变体丧失了产生质荷比从2050 到2200之间的产物 （c）QS系统调控拮抗活性和细胞坏死。拮抗活性和细胞死亡检测同图1。所有试验均设置3次重复且结果一致。 BGC7是地中海假单胞菌调节植物免疫的关键 BGC7 is required for P. mediterranea to modulate plant immunity 由于BGC7突变体不能引起本氏烟的细胞死亡，我们研究了其是否影响电解质的泄漏，以地中海假单胞菌S58∆fliC作为对照。正如预期，S58∆BGC7的电导率明显低于S58和S58∆fliC（图4(a)）。为了进一步研究BGC7功能丧失对PTI和植物抗性的影响，我们检测了ROS爆发、胼胝质沉积和开展了挑战接种实验。结果显示，S58触发了强烈的ROS爆发，而S58∆fliC在本氏烟中完全丧失了产生ROS的能力。而一旦我们沉默了本氏烟中鞭毛蛋白受体FLAGELLIN SENSING 2（fls2），菌株S58就不能再引发ROS爆发（图4(b)）。这表明鞭毛蛋白是地中海假单胞菌中主要的PTI-ROS诱导子。BGC7突变体诱导的ROS峰值与菌株S58相同，但其ROS积累量下降的速度较慢（图4(b)）；此外，BGC7突变体在fls2沉默植株上诱导的ROS积累量与BGC7/fliC双突变体在野生型植株上诱导的ROS积累量相似，且比S58菌株在fls2沉默植株上诱导的ROS积累量下降得更慢（图4(b)），这表明BGC7可能参与了对地中海假单胞菌其他因素诱导的弱ROS产量的抑制。菌株S58可以在接种后24 h诱导胼胝质沉积（图4(c)），而S58∆fliC和S58∆BGC7在相同条件下诱导胼胝质沉积的能力明显减弱（图4(c)）。为了检测对病原菌抗性，我们将菌株S58和突变体以1×105 cfu/ml的浓度接种本氏烟，并在6 小时后挑战接种浓度为3 × 104 cfu/ml的致病菌丁香假单胞菌番茄致病变种（P. syringae pv. tomato，Pst） DC3000∆hopQ1-1（图4(d)）。结果显示，敲除fliC不影响菌株S58诱导的对病原菌的抗性（图4(d)）。相比之下，S58∆BGC7诱导的对丁香假单胞菌的抗性显著降低。综上所述，BGC7及其产物有助于植物免疫和抵抗病原菌侵染。  图4. BGC7突变体减弱了触发免疫反应的能力。 （a）与野生型菌株S58相比，S58∆BGC7接种本氏烟叶片的引起的电解质泄漏显著减少； （b）S58∆BGC7对fliC-诱导的早期ROS产生无抑制能力。“wt”表示野生型本氏烟，“TRV-fls2”表示沉默fls2基因的本氏烟； （c）与菌株S58相比，S58∆BGC7减弱了本氏烟的胼胝质沉积。胼胝质沉积的定量结果在对应显微图片的右侧； （d）与菌株S58相比，接种S58∆BGC7后显著降低了本氏烟对Pst DC3000∆hopQ1-1的抗性。首先在本氏烟叶片上接种浓度为1 × 105 cfu/ml的S58及突变体菌悬液，6 h后接种浓度为3 × 104 cfu/ml的病原菌，接种4 d后检测病原菌的群体数量。所有数据为3次重复的平均值±标准差（**表示P < 0.01），所有试验均重复3次且结果一致。 比较转录组分析揭示了一组免疫信号候选基因 Comparative transcriptome analysis reveals a set of immune signaling candidates 为了解析菌株S58激发的本氏烟免疫谱，我们对菌株S58和S58ΔBGC7的菌悬液和粗提取物处理过的本氏烟叶片进行了转录组测序分析。首先分析了不同处理的差异表达基因（differentially expressed genes，DEGs），与对照处理相比，总体差异显示野生型和突变体的转录组变化明显不同（fold change ≥2 and P < 0.05）。S58菌悬液和S58提取液处理影响大量的DEG（>3000），而S58ΔBGC7菌悬液和S58ΔBGC7提取物处理所影响的数量要少得多（<1500）（图5(a)）。因此，断定BGC7的存在与否与这两种极端反应有关。此外，通过对DEG的系统聚类分析可以将DEG分成两大簇，其中B簇包含BGC7突变处理中转录丰度降低的基因（附录a中的图S2(a)）。同时，我们发现了受S58菌悬液和提取物共同调控的高度重叠的基因（1998个基因），其占S58菌悬液影响基因的54.1%和S58提取物的62.9%，表明胞外次生代谢物在与植物相互作用中起主要作用。  图5. 筛选本氏烟中受medpeptin诱导的基因（medpeptin-induced genes, MIGs）。 （a）S58和S58ΔBGC7菌悬浮及其萃取物与1%甲醇对照处理后引起的本氏烟基因差异表达谱（以≥2倍变化和P < 0.05为阈值）； （b）利用韦恩图筛选MIG候选基因； （c）菌株S58和S58ΔBGC7处理后本氏烟中28个MIG基因的相对表达量。以NbEF1α作为内参基因，利用2-ΔΔCt公式计算相对表达量； （d）菌株S58在28株基因沉默植物上诱导细胞死亡检测。将浓度为5 × 108 cfu/ml的菌悬液接种在不同沉默植株上并于48 h拍照记录。每个图片下方对应分数表示相对于试验接种次数观察到的细胞死亡次数； （e）沉默MIG25或MIG28基因显著减弱菌株S58诱导的电解质渗漏；（f）沉默MIG25或MIG28基因显著降低菌株S58诱导的对病原菌Pst DC3000∆hopQ1-1的抗性。病原菌的接种方法同图4（d）。所有数据为3次重复的平均值±标准差（**表示P < 0.01），所有试验均重复3次且结果一致。 在本研究中，我们关注的是BGC7衍生的medpeptin特异性诱导表达的一组基因（简称MIG基因）。首先，我们排除了S58ΔBGC7菌悬液和S58ΔBGC7提取物诱导的997个基因。其余1001个基因与S58菌悬液处理中表达量高于S58ΔBGC7菌悬液、S58提取物处理中表达量高于S58ΔBGC7提取物的基因相交，最终256个基因被鉴定为MIG候选基因（图5(b)）。我们使用本氏烟基因组序列作为参考（图S2(b)；表S3）进行了基因GO分析。涉及的生物过程（biological process）主要包括“磷脂或钙离子跨膜运输”和“蛋白质磷酸化或泛素化”。在细胞成分（cellular component）类别中，主要涉及“膜组分”和“细胞外围”。此外，分子功能（molecular function）分析显示，大多数MIG候选基因富集在“钙或ATP结合”、“转录因子”和“蛋白激酶”，其中大部分参与免疫激活和信号通路。为了确定本氏烟对medpeptin的整体转录网络反应，我们进行了MapMan分析（https://mapman./），以进一步研究和可视化MIG基因的作用。结果显示，256个MIG基因更明显地映射到生物应激响应途径（图S2(c)），包括细胞壁相关过程、激素信号传导、信号转导和代谢途径。这些结果表明，medpeptin通过与细胞壁成分相互作用、调节激素的产生、改变次生代谢产物的合成等过程，在植物防御反应中起作用。 鉴于蛋白激酶和转录因子在免疫应答中的重要性，我们分析了两类MIG候选基因的家族。在256个MIG基因中，共鉴定出15个TF家族，共有30个TF编码基因（图S2(d)）。AF2/ERF、WRKY和MYB是前三个家族，其中包括许多已知在免疫应答中起作用的基因：EFR1、WRKY1、WRKY18和MYB1（表S3）[50-53]。在蛋白激酶方面，我们发现了21个蛋白激酶分布在14个家族中，富集量最多的为CAMK_CDPK和RLK_Pelle_LRR（图S2(e)），它们参与驱动多种生物学过程，从细胞壁相互作用到抗病反应[54,55]。综上所述，我们的研究揭示了地中海假单胞菌的medpeptin介导的以前未知的植物转录重编程。 沉默MIG28和MIG25影响菌株S58诱导的细胞死亡免疫 Silencing of MIG28 and MIG25 compromises cell death immunity 为了验证MIG基因，基于全面的生物信息学分析（GO和KEGG富集分析）和文献检索，选择了包括跨膜蛋白、蛋白激酶和转录因子在内的41个候选基因（图S2(f)；表S4）经qRT-PCR验证，我们确定了28个基因受菌株S58诱导表达，但在S58ΔBGC7处理下表达显著降低（图5(c)）。为了确定MIG基因之间潜在的相互作用，我们利用这28个基因在拟南芥中的同源物构建了一个蛋白质-蛋白质相互作用（PPI网络）模型（图S3；表S5），形成的PPI互作网络包含33个节点，对应26个基因涉及35个互作因子，覆盖了78.6%的MIG基因。利用k-means聚类分析生成了三个高度连接的聚类。值得注意的是，第I簇包含与细胞外基质组织和细胞内信号转导相关的条目和途径，特别是包括GO分析中的“响应刺激反应”、“蛋白质或肽基丝氨酸磷酸化”、“钙依赖性激酶活性”和“细胞外围或质膜”。第II簇富含核DNA结合，与与响应外部刺激和先天免疫反应的激活有关。第III簇主要与囊泡对接、胞吐、细胞分裂和SNAPE结合等条目或功能相关。这些特征暗示medpeptin可能参与了一个完整的PPI网络，该网络由从质膜到细胞核的免疫信号组成。 为了探究MIG基因对地中海假单胞菌诱导的细胞死亡的潜在影响，我们利用VIGS技术在本氏烟上对选择的28个基因进行了分析。以含有大肠杆菌DNA片段（Escherichia coli-derived DNA fragment，EC1）作为对照。我们成功获得了除MIG7和MIG24基因外的26个MIG基因的VIGS植株。VIGS植物的生长和形态没有明显的变化，并通过qRT-PCR检测确认相应基因的转录量显著降低（图S4(a)和(b)）。在沉默的植物上接种地中海假单胞菌S58（接种浓度5 × 108 cfu/ml），以确定候选基因是否参与了的菌株S58引发的细胞死亡。在26个候选基因中，发现一个细胞壁富含赖氨酸的重复延伸基因（MIG28, NbLRX3, Niben101Scf08263g03011.1）或一个类受体激酶基因（MIG25, NbRLK25，Niben101Scf06437g00005.1）沉默后，与EC1对照相比，会显著影响S58引起的细胞死亡（≥80%）（图5(d)）。此外，沉默MIG2或MIG17会中度损害S58诱导的细胞死亡（≥1/2），而沉默MIG20、MIG22或MIG26会阻碍菌株S58诱导的≥1/3的细胞死亡（图5(d)）。考虑到MIG28和MIG25的显著作用，我们进行了电解质泄漏和致病性检测。结果显示，菌株S58在EC1对照植株中诱导的电导率显著高于S58∆BGC7（图5(e)）。然而，S58和S58∆BGC7诱导的电导率在MIG28或MIG25沉默的植株中没有显著差异（图5(e)）。同样，在EC1对照植物中，菌株S58诱导的对丁香假单胞菌的抗性明显强于S58∆BGC7（图5(f)）。一旦MIG28或MIG25基因被沉默，菌株S58失去了对病原体侵染的抵抗力，病原菌的生长和致病症状与S58∆BGC7相同（图5(f)）。这些结果表明，MIG28和MIG25在medpeptin触发免疫的识别和信号转导中至关重要。 MIG28和MIG25是两个含有不同结构域的蛋白激酶。MIG28蛋白的氨基酸序列与拟南芥LRX3（AT4G13340.1）有58%的同源性，拟南芥LRX3是一种细胞外蛋白，具有一个N端信号肽、10个富含亮氨酸的重复序列（LRR）和一个含有富含羟基脯氨酸糖蛋白（HRGPs）的C端延伸蛋白结构域。AtLRX3定位于细胞壁，在细胞壁完整性、植物生长和盐胁迫耐受调节中起重要作用[56]。相比之下，NbLRX3保留了保守的N端信号肽和LRR结构域，但具有短而可变的延伸蛋白结构域（图S5(a)）。MIG25蛋白被注释为丝氨酸/苏氨酸酪氨酸蛋白激酶，与拟南芥AT4G10390.1具有52%的一致性，预测参与创伤反应（GO:0009611）。在MIG25的激酶结构域之外没有发现其他结构域/基序或定位信号（图S5(b)）。对来自各种植物的MIG28或MIG25的系统发育分析表明，这两种蛋白在双子叶、单子叶和其他植物中是保守的，但来自茄属植物的蛋白聚集在一起（图S6(a)和(b)）。总的来说，我们的研究结果揭示了细菌CLPs可以通过细胞壁感知和细胞质信号传导调节植物免疫。  图6. Medpeptin的结构鉴定及其在诱导植物免疫中的功能。 （a）medpeptin中氨基酸组成的预测。mepABC基因簇与图2（a）一致，其中腺苷化（A）、硫醇化（T）、缩合（C）和硫代酯酶（TE）结构域分别以不同的颜色显示； （b）菌株S58和S58∆BGC7发酵上清粗提物的HPLC色谱检测结果。与野生型菌株相比，S58∆BGC7粗提取物在保留时间为5.17 min和5.25 min时缺少相应产物； （c）采用LC-MS/MS法测定medpeptin的氨基酸序列和离子峰； （d）基于基因组预测和LC-MS/MS分析得到的medpeptin的化学结构；（e）Medpeptin与相近CLPs的结构比对。每个肽链的C端与苏氨酸的羟基形成大内酯环。Dhb为脱氢丁氨酸，Dha为脱氢丙氨酸，Dab为2,4-二氨基丁酸，Hse为高丝氨酸； （f）medpeptin触发本氏烟依赖于MIG28和MIG25的细胞死亡，但其自身不具有拮抗活性。利用10 μl 1 mM medpeptin接种本氏烟和点接对峙检测其诱导细胞坏死和拮抗病原的能力。菌株S58点接于平板左侧，medpeptin纯化产物点接于右侧，每个处理重复3次。每个图片下方对应分数表示相对于试验接种次数观察到的细胞死亡次数； （g）medpeptin能够引起EC1对照植株的电解质渗漏，但不能引起沉默MIG25和MIG28基因的植物电解质渗漏； （h）medpeptin能够诱导EC1对照植株对Pst DC3000∆hopQ1-1产生抗性，而不能诱导沉默MIG25和MIG28基因的植物产生抗性。首先在本氏烟叶片上接种浓度为100 nM medpeptin，6 h后接种浓度为3 × 104 cfu/ml的病原菌，接种4 d后检测病原菌的群体数量； （i）medpeptin不能触发ROS的产生，也不抑制flg22触发的ROS爆发。利用1 μM medpeptin预接种本氏烟，6 h后收集叶碟用于测定ROS爆发。所有数据为3次重复的平均值±标准差（**表示P < 0.01），所有试验均重复3次且结果一致。 Medpeptin的结构鉴定及其在细胞死亡和植物抵抗病原菌侵染中的作用 Medpeptin structure and role in cell death and plant resistance to pathogen infection 生物信息学分析表明，BGC7由22个模块组成，每个模块具有腺苷化（A）、硫代化（T）和缩合（C）结构域。mepC基因的C端编码两个硫酯酶（TE）结构域，意味着medpeptin合成的终止（图6(a)）。我们之前通过MALDI-TOF比较菌株S58和BGC7突变体的代谢物谱，证明medpeptin可能的质荷比范围在m/z 2050到m/z 2200之间（图2(b)）。我们进一步使用更有效的LC-QTOF（Agilent 1290-6530）对比了这两种菌株的代谢物差异。菌株S58的洗脱谱显示，菌株S58ΔBGC7在保留时间为7.17 min和7.25 min时缺少两个相邻的主要峰（图6(b)；图S7(a)）。粗提物的目标脂肽在第一次制备高效液相色谱纯化后保留0-15 min的洗脱液中，然后再次对单峰纯化，得到纯度为93.22%的单体化合物且其质荷比为2107.24（图S7(b)和(c)）。通过二级质谱和MALDI-TOF-MS分析，结果显示，medpeptin由22个氨基酸残基（Dhb-Pro-Ala-Ala-Pro-Val-Val-Dhb-Thr-Val-Ile-Dha-Ala-Ala-Ala-Val-Dhb-Thr-Ala-Dab-Ser-Va）组成，并附有3-羟基脂肪酸链（图6(c)和(d)）。Medpeptin肽链包含三种非蛋白质原性氨基酸，分别为Dab（2,4-二氨基丁酸）、Dhb（脱氢丁氨酸）和Dha（脱氢丙氨酸）（图6(c)-(e)），它们普遍存在于一些非核糖体肽家族中，包括tolaasin和syringopeptin家族[3,9]。在m/z 2107.24 [m + H]+中包含一个16个氨基酸残基组成的典型肽段，其序列为Pro-Ala-Ala-Pro-Val-Val-Dhb-Thr-Val-Ile-Dha-Ala-Ala-Ala-Val-Dhb。此外，两个较大的碎片出现在质谱m/z 254.15和m/z 459.26处。质荷比为254.15片段的分子式与连接到3-羟基癸酸的Dhb残基相关，这与corpeptin和thanapeptin相似（图6(e)）[21,49]。质荷比为459.26片段的包含一个由Thr-Ala-Dab-Ser-Val形成的内酯环，除了最后一个氨基酸残基（图6(e)）外，其他均与corpeptin、nunapeptin和thanapeptin的成环结构相似[21,48,49]。 为了证实地中海假单胞菌S58诱导的植物细胞死亡免疫依赖于medpeptin，我们检测了纯化的medpeptin是否能够诱导细胞死亡和抗病性。值得注意的是，与EC1对照相比，1 μM medpeptin接种本氏烟后24 h，导致细胞完全死亡和显著的电解质泄漏，而本氏烟沉默MIG25或MIG28可消除medpeptin诱导的细胞死亡和电解质泄漏（图6(f)和 (g)）。此外，与空白对照相比，预先接种100 nM medpeptin 6 h显著增强抑制病原菌的生长。相比之下，medpeptin未能抵御TRV-MIG25和TRV-MIG28植株中的丁香假单胞菌的侵染（图6(h)）。我们进一步研究了medpeptin是否能够介导抗菌、ROS激发、胼胝质沉积、表层免疫和细胞死亡相关基因的表达以及活性抑制，结果表明medpeptin不能拮抗植物病原菌，也不能触发ROS爆发和抑制flg22触发的ROS产生（图6(f)和(i);图S8(a)），我们还注意到medpeptin可以引起胼胝质沉积以及表层免疫和细胞死亡相关基因的表达（图S8(b)和 (c)），这与S58∆BGC7的表型一致（图2(a)；图4(b)和(c)）。这些结果表明medpeptin是地中海假单胞菌S58诱导细胞死亡的关键激发子。众所周知，BAK1和SGT1对于表层免疫（PTI）和效应蛋白触发的免疫（ETI）至关重要。例如，Pst DC3000依赖hopQ1-1触发的细胞死亡（图7(a)；图S9）。进而，我们探究了这两种蛋白是否参与medpeptin触发的细胞死亡。我们使用VIGS技术沉默了本氏烟中的BAK1和SGT1。然而，medpeptin和地中海假单胞菌S58在TRV-BAK1和TRV-SGT1植物中仍然保留激发细胞死亡的能力（图7(a)；图S9）。这一研究结果表明，medpeptin诱导的细胞表面免疫不同于已知的PTI和ETI信号通路。  图7. CLP感知和信号传导模式图。 （a）P. mediterranea S58和medpeptin诱导产生不依赖BAK1和SGT1的细胞坏死。分别在沉默NbBAK1和NbSGT1基因的本氏烟植株上接种1 μM Medpeptin和5 × 108 cfu/ml的S58和S58ΔBGC7观察细胞坏死情况，以接种5 × 108 cfu/ml的P. syringae pv. tomato DC3000（Pst DC3000）作为非宿主病原菌的对照。每个图片下方对应分数表示相对于试验接种次数观察到的细胞死亡次数。所有试验均设置3次重复且结果一致；（b）CLP的识别和免疫通路。有益假单胞菌产生的CLPs被位于细胞壁的富含亮氨酸的重复延伸蛋白（LRX）感知，然后免疫信号通过定位在质膜的受体激酶（RLK）传导至MAPK级联。而位于下游的钙依赖蛋白激酶（CDPK）或CBL互作蛋白激酶（CIPK）也可能参与信号传导，随之EFR和WRKY家族的转录因子调控下游基因表达，最终引起细胞坏死和抗病反应。 - 讨论 - 假单胞菌中荧光假单胞菌分支表现出显著的代谢多样性，使它们能够在各种生态位中占据生长优势。Ps-CLPs因其结构多样性、广谱抗菌和生态功能，被称为分子物质界的“瑞士军刀”。然而，目前对CLP结构和功能的理解，特别是植物细胞对CLP的感知机制仍然不清楚。在这里，我们发现NRPS基因簇BGC7及其产物medpeptin在地中海假单胞菌S58诱导的植物细胞死亡免疫中起关键作用。对转录组网络的进一步研究表明，medpeptin感知需要一组不同于广泛认知的双层免疫系统的免疫信号蛋白。据我们所知，这是Ps-CLP通过细胞壁感知和细胞质信号激活细胞表层免疫的首次报道。这项研究拓宽了假单胞菌代谢物作为生物防治剂的范围，并凸显了CLP诱导植物抗性的新免疫网络和机制。 土壤和植物相关假单胞菌是一大类能够产生CLP的细菌。根据脂肪酸尾部的组成和长度以及寡肽结构，已知的Ps-CLPs可分为14个具有多个同源成员的不同类群。本研究发现的medpeptin在肽链上包含22个氨基酸与3-羟基癸酸偶联，结构与corpeptin、thanapeptin和braspeptin高度相似。然而，medpeptin不能抑制研究中所用的6种具有代表性的植物病原菌生长，这与同类CLPs（如P. fluorscens In5中的nunamycin和nunapeptin）的功能活性不同。Medpeptin和这些CLPs之间的氨基酸差异是否影响抗菌活性仍有待阐明。此外，我们还发现了一个质量为2109的小峰，与medpeptin非常接近，这让人怀疑菌株S58可能依赖此产物抑制微生物生长。据报道，单个生物合成的NRPS簇可能产生多个衍生的CLP，由于参与氨基酸识别的一些腺苷化结构域的灵活性，这些CLP的氨基酸种类不同。例如，P. protegens菌株产生orfamide A和orfamide B，它们仅相差一个氨基酸，但对番茄疫病菌具有相同的活性，并导致疫霉菌的游动孢子裂解。Pseudomonas sp. SH-C52能产生7种thanapeptin结构变体，对P. infestans表现出不同程度的活性。尽管我们没有确定地中海假单胞菌S58的衍生产物，但综合利用CLP提取物和生物合成突变体的研究表明，BGC7簇及其产物不负责微生物的拮抗，排除了衍生峰具有抗菌活性的可能性。在本研究中，我们证明假单胞菌QS系统不仅严格控制medpeptin的产生，而且严格控制未知代谢物对植物病原真菌和革兰氏阴性菌的拮抗作用。有趣的是，绝大多数Ps-CLPs对革兰氏阴性菌无活性，这意味着地中海假单胞菌招募了多种抗菌代谢物来抑制不同的病原体类别。鉴于根据我们的基因组分析，地中海假单胞菌具有代谢多样性，针对特定病原体的代谢“包”的深入研究将显著推进精准的植物保护。 CLPs除了通过抗菌特性直接作用于病原菌外，还能够诱导植物对产生免疫抗性。有趣的是，medpeptin只诱导植物抗性，而不诱导抗菌活性，这与一般的Ps-CLPs完全不同。鉴于这种独特的性质，medpeptin有潜力被开发成一种新的植物健康保护剂，它只激活植物免疫系统，但不干扰微生物的共生作用。在这里，通过化学提取和细菌突变体的双向的严谨分析，我们证明了地中海假单胞菌中的medpeptin主要依赖NbLRX3和NBRLK25诱导本氏烟的免疫反应。LRXs是不溶于细胞壁的嵌合蛋白，可为蛋白质之间相互作用创造基础。有趣的是，LRX3/LRX4/LRX5蛋白被证明与植物内源肽快速碱化因子（RAPID ALKALANIZATION FACTORs，RALFs）具有高亲和结合力。由于缺乏胞内结构域，LRX蛋白通过招募RECEPTOR-LIKE PROTEIN KINASE 1-LIKE (CrRLK1L) FERONIA（FER）将细胞壁信号转导到细胞内部，从而调节细胞壁完整性、根毛形态发生和盐胁迫耐受性。此外，最近研究表明，LRXs和FER调节BAK1微结构，并且lrx3/4/5三重突变体在PTI介导的ROS产生受损，这表明FER和LRXs在调节发育和免疫方面具有双重功能。虽然到目前为止还没有证据表明FER与medpeptin触发的免疫有关，但我们发现BAK1（图7(a)）、FLS2、MKK2、SIPK和WIPK均未参与medpeptin激发免疫过程（数据未显示），排除了medpeptin通过LRXs-FER-BAK1途径激活植物免疫的可能性。我们还研究了medpeptin信号是否与典型的ETI调节因子相关。然而，沉默SGT1（图7(a)）、RAR1、HSP90、EDS1和NDR1（数据未显示）并没有改变medpeptin引发的本氏烟细胞死亡。 本研究建立了植物体感知Ps-CLP及其下游信号传导的模型（图7(b)）。与PRR介导的PTI和NLR介导的ETI相比，有益假单胞菌产生的medpeptin类CLP可通过细胞壁LRX直接或间接被感知。免疫信号通过质膜结合类受体激酶（RLK）转导到细胞质并激活下游信号传导（如MAPK级联），其中钙依赖性蛋白激酶（CDPK）和/或CBL相互作用蛋白激酶（CIPK）可能参与植物防御信号传导。随后，转录因子如ERF和WRKY结合并调节下游基因表达，激发细胞死亡和抵抗病原菌的侵染。鉴于假单胞菌中Ps-CLPs的结构相似性，深入对CLP信号传导机制的了解将为植物抗病机制的研究开辟新的视角。 参考文献 Yi-Lin Gu, Jun-Zhou Li, Yan Li, Shen Cong, Jing Wang, Yi-Nan Ma & Hai-Lei Wei. (2023). Pseudomonas Cyclic Lipopeptide Medpeptin: Biosynthesis and Modulation of Plant Immunity. Engineering, doi: https:///10.1016/j.eng.2023.05.016 - 作者简介 - |
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