 概述      黑木耳又名木耳、光木耳、云耳、桑耳等，属木耳科，含有丰富的蛋白质、多糖、维生素等营养物质，是一种重要的食（药）用真菌，具有延缓衰老，增强机体免疫力，以及预防癌症发生等功效。另外，由于其生长周期短，资源丰富，产量大和安全性高等特点，近年来各种动物性疾病、水体污染及宗教信仰限制了动物性蛋白的应用，因此拓展植物性蛋白具有非常大的研究意义。胶原蛋白是一种天然生物高分子，是哺乳动物常见功能蛋白，作为动物结缔组织中的主要成分占蛋白质总量的25～30%，有些生物体甚至超过80%。虽然哺乳动物组织以及骨胳是天然胶原蛋白、天然胶原蛋白肽的最重要来源，但因为某些宗教信仰的原因和某些动物患有疾病，限制了动物来源胶原蛋白及其制品的使用，人们把视线由陆地动物逐渐转向海洋生物以及植物方向。 分析  氨基酸组成分析 由表2可知，黑木耳胶原蛋白中缺少胱氨酸，甘氨酸含量达到22.6%，除甘氨酸外，丙氨酸8.9%、谷氨酸10.3%和精氨酸5.5%，黑木耳胶原蛋白中脯氨酸和羟脯氨酸含量分别为8.4%和5.2%，这与胶原蛋白的特征氨基酸相一致，说明所提取的物质为类似胶原蛋白的物质，但相比较其他物质含量较少，这与物种的来源有关。胶原蛋白的亚氨基酸（Pro+Hyp）吡咯环影响二级结构变化，Hyp通过羟基形成链间氢键。据报道，不同来源的胶原蛋白亚氨基酸的含量差异很大，与水产动物胶原蛋白相比含量较少，故其亚氨基酸的含量普遍偏低，8种必需氨基酸含量占整体的22.8%，从食品的角度说明黑木耳蛋白具有较高的营养价值。   紫外光谱分析 由图1黑木耳胶原蛋白紫外光谱分析可看出，在200～400nm 范围内有明显的吸收峰，吸收峰位置出现在221nm 处，胶原蛋白在220nm 前后有强吸收峰，和一般蛋白质区别为，一般蛋白质含有共轭双键体系的酪氨酸和色氨酸，而胶原蛋白基本不含色氨酸和酪氨酸，且Ⅰ型胶原蛋白的一级结构中缺乏酪氨酸、苯丙氨酸等具有共轭双键的芳香族氨基酸，在280nm处没有最大吸收峰，紫外吸收图谱和一般蛋白质有较大区别，这也是鉴定胶原蛋白的依据。黑木耳胶原蛋白与Ⅰ型胶原蛋白紫外图谱基本一致，在221nm处有强吸收峰，在250～400nm范围内没有明显的吸收峰，符合Ⅰ型胶原蛋白基本特征，该紫外吸收图谱无杂峰，说明提取的胶原蛋白纯度较高。 红外光谱分析 由图2和表3可得，黑木耳胶原蛋白在酰胺A、酰胺B、酰胺Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ处均具有胶原蛋白红外特征吸收峰。3433.95cm-1为酰胺A带，是由于N-H伸缩振动引起的特征吸收峰，由于NH基团与H键结合产生蓝移现象说明黑木耳胶原蛋白含有H键；由于-CH2-不对称伸缩振动，可看到2925.60处为酰胺B带，是胶原蛋白特征吸收峰，也是与其他蛋白质分子的不同之处。 酰胺Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ带的伸缩振动与胶原蛋白氨基酸序列及三股螺旋结构直接相关。其中酰胺Ⅰ在1646.63cm-1有-CO-伸缩振动，伴随H键，是胶原蛋白结构变化敏感地带，说明胶原分子处于交联状态，与二级结构有关，对应α-螺旋结构。酰胺Ⅱ出现在1421.71cm-1、1376.97cm-1处，酰胺Ⅱ为α-螺旋、β-折叠转角、无规则卷曲的扭转震动峰。胶原蛋白Gly、Pro、Hyp含量相对较高，在1376.97处有特征吸收峰，在1200～1400 cm-1范围内有特征吸收峰是由于在该处有CN伸缩振动和NH弯曲。酰胺Ⅲ表明胶原蛋白是三股螺旋结构，是Gly和Hyp残基的CH2特征振动峰。在1249.4cm-1处有特征吸收峰，是由于-NH-弯曲与CN伸缩，对应吸收带的β-折叠结构。综合得出，黑木耳胶原蛋白符合Ⅰ型胶原蛋白的特征，具有完整的三股螺旋结构。 圆二色谱 蛋白质溶液的圆二色谱可以反映出蛋白质的立体结构信息，远紫外区是肽键的吸收峰范围，反应蛋白质主链的构象。黑木耳类胶原蛋白在远紫外区（190～260nm）的圆二色谱图如图3所示，在223nm处有特征吸收峰，是左旋聚脯氨酸构型肽链的典型特征；负槽的曲线形状与蛋白质主链构象有亲密的关系，在198nm处有负吸收峰，说明胶原蛋白存在三重螺旋结构，胶原蛋白结构完整，该负吸收峰是Ⅰ型胶原分子构象中无规则卷曲结构的典型特征。胶原三螺旋结构特征性参数为正吸收峰与负吸收峰的比值（Rpn）胶原蛋白的三重螺旋结构完整性与比值呈正相关。结果显示Rpn ≈ 1.13，该数据说明三重螺旋结构完整。 黑木耳胶原蛋白SDS-PAGE电泳分析 黑木耳胶原蛋白SDS-PAGE图谱如图4所示，黑木耳中胶原蛋白在97.2KDa和116KDa处有两条条带，在α链中一条在97.2KDa处，另一条在116KDa附近。由链和链泳带颜色的深浅及光密度可以大致推断前者含量约是后者的两倍，由此推断胶原蛋白分子是由两条相同的链和一条不同的链组成的异源三聚体结构。根据相关报道，由两个不同亚基的存在及含量比例，可初步判断本实验所制备的胶原蛋白可能是Ⅰ型胶原蛋白。 黑木耳胶原蛋白热变性分析 研究表明，决定热稳定性的因素是脯氨酸和羟脯氨酸组成的吡咯环以及羟脯氨酸羟基间部分氢键。图5为黑木耳胶原蛋白差式量热扫描图，可以看出黑木耳胶原蛋白的Td值是117.4℃，高温使胶原蛋白的氢键断开，过程中吸收热量，有序的三股螺旋结构被破坏，胶原蛋白生物活性丧失，发生变性。研究表明亚氨基酸与胶原蛋白有着紧密联系，亚氨基酸含量越高，胶原蛋白的热变性温度则越高，可以用DSC来推断其稳定性。热变性温度与胶原蛋白亚氨基酸含量有关，如图5所示黑木耳胶原蛋白样品在117.4℃时出现了最大峰值，表明在此温度时胶原蛋白的有序结构已经发生变性，对应焓值为45.43J/g。 扫描电镜微观结构分析 胶原蛋白的微观结构可以展现出其生物学作用，利用扫描电镜对提取的胶原蛋白进行微观结构观察，如图6所示。样品黑木耳胶原蛋白呈现海绵质地，疏松多孔，呈纤维网状结构，说明保持了完整的纤维结构，与海洋性胶原蛋白结构类似。 结论 采用碱性蛋白酶法及盐析、离子交换层析、凝胶过滤层析等方法对黑木耳胶原蛋白进行提取、纯化，并对其理化特性进行分析。通过氨基酸分析发现黑木耳胶原蛋白组成成分基本一致，必需氨基酸占比含量较高，具有较高的营养价值；采用紫外全波长扫描，在221nm处有强吸收峰，在250～400nm范围内没有明显的吸收峰，符合Ⅰ型胶原蛋白基本特征。傅里叶红外光谱分析黑木耳胶原蛋白含有4个酰胺段，均显示出胶原蛋白的特征吸收峰。通过圆二色谱分析发现，黑木耳胶原蛋白在198nm处有负吸收峰，说明胶原蛋白存在三重螺旋结构，胶原蛋白结构完整，结果显示Rpn≈1.13，说明三重螺旋结构完整。通过SDS-PAGE凝胶电泳发现黑木耳胶原蛋白含有两条不同的α链，即α1链和α2链，其中α1链在97.2KDa处，α2链分子量则在116KDa附近。推断胶原蛋白分子是由两条α1链和一条α2链组成的异源三聚体结构，可以推断构型符合Ⅰ型胶原蛋白基本特征。确定了黑木耳胶原蛋白的热变性温度为17.4℃ ；通过扫描电镜发现黑木耳胶原蛋白呈现纤维网状结构。确定了黑木耳胶原蛋白的基本构型，拓展了黑木耳蛋白的发展空间，为后续食品、生物、医药、化妆品方面的应用奠定了基础。 参考资料： [1]那治国,贺鑫,孟桥,等.黑木耳胶原蛋白结构性质研究[A].中国食品添加剂,2023,1: 145-151. |
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