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1. Miktoarm 星形纳米粒子与 siRNA 复合物形成小型无毒纳米复合物使用聚（2-二甲基氨基乙基甲基丙烯酸酯）（PDMAEMA）和聚[低聚（乙二醇）甲基醚甲基丙烯酸酯]（POEGMA），通过可逆加成-断裂链转移（RAFT）聚合法合成核交联米克托臂星形聚合物纳米颗粒（星形纳米颗粒），方法如前所述，略有改动。合成 PDMAEMA 和 PEOGMA 均聚物可得到窄分散（ÐPDMAEMA = 1.16，Ð POEGMA = 1.20）的前体，这些前体很容易通过伸链 RAFT 聚合（臂先法）进行交联。N,N′-双丙烯酰（胱胺）作为双官能团单体可促进交联生成星形纳米粒子，其比例为 POEGMA/DMAEMA = 12.5/87.5 mol%，具有高摩尔质量和低分散性。乙烯基氮杂环内酯对胺具有反应性，因此可以直接用 Cy5.5-amine 进行标记。在中性 pH 值下，星形纳米粒子的平均流体力学直径为 14.4 nm，多分散指数为 0.18（数据未显示），表面正电荷为 +8.5 mV。星形纳米颗粒的表观 pKa 为 6.1。 2. Star-siRNA 纳米粒子通过凝集素介导的内吞作用进入人类肺癌细胞，并逃脱内溶酶体降解途径为了研究星状siRNA纳米颗粒在人肺癌细胞中的内化和细胞内迁移，作者制备了7:1、14:1和28:1 N/P的荧光标记星状siRNA纳米颗粒，并使用共聚焦显微镜和流式细胞术测量了细胞摄取量。从转染后 30 分钟开始观察星状-siRNA 纳米颗粒的内化情况。在此时间点，与 7:1 N/P 相比，14:1 和 28:1 N/P 条件下肺癌细胞摄取了更多的 star-siRNA 纳米颗粒。转染后四小时，三种 N/P 比率的纳米颗粒都被肺癌细胞内化。放大的共聚焦显微镜图像显示，在这两个时间点，所有比例的星形纳米颗粒和 siRNA 都存在于细胞膜中。纳米颗粒递送 siRNA 的效率不仅取决于细胞的吸收，还取决于其保留和逃脱溶酶体内降解途径的能力[51]。携带 siRNA 的纳米颗粒通过外泌作用被回收出细胞，导致基因沉默活性受损。
3. 体外 Star-siRNA 纳米粒子可减少肺癌细胞中靶蛋白的表达为了研究不同N/P比的星型siRNA纳米颗粒在细胞内的迁移变化是否与基因沉默活性相关，用靶向βⅢ-tubulin（星型βⅢ-tubulin siRNA）的星型siRNA纳米颗粒转染人肺癌细胞（A549和H1299），N/P比不断增加。与对照组相比，7:1 N/P时βⅢ-tubulin蛋白的表达量只有适度的减少（A549细胞为30%，p < 0.01；H1299细胞为14%，无统计学意义）。相比之下，在 28:1 N/P 条件下，βⅢ-tubulin 蛋白的敲除水平在 A549 细胞中增加到 77%（p < 0.0001），在 H1299 细胞中增加到 75%（p < 0.001），与市售载体 lipofectamine 2000™ 的效果相当。 4. 通过全身给药或气溶胶给药，Star-siRNA 纳米粒子在小鼠的肿瘤肺中蓄积鉴于体外实验的良好结果，作者研究了星形-siRNA 纳米粒子在体内的表现。作者首先研究了星型 siRNA 在具有功能性免疫系统的同种异体肺癌小鼠模型中的生物分布。通过全身给药或气溶胶给药，C57BL/6小鼠正位生长的LLC肺肿瘤接受了Cy5.5-star-siRNA纳米颗粒的治疗，并在治疗后1、4和24小时收集器官进行红外体外荧光成像和共聚焦显微镜检查。不出所料，通过全身给药，star-siRNA 纳米粒子在早期时间点就在肾脏、肝脏、脾脏和肺部积累。值得注意的是，作者在全身给药星形 siRNA 纳米颗粒时未发现严重的急性肝脏或肾脏毒性或急性免疫原性。
5. 气溶胶递送星形-βⅢ-微管蛋白 siRNA 纳米颗粒可减少βⅢ-微管蛋白的表达并延缓正位人肺部肿瘤的生长由于作者的数据显示，星形 siRNA 纳米粒子可通过雾化器气雾化并输送到肿瘤小鼠的肺部，因此作者决定采用这种方法进行临床前试验，以确定它是否能抑制βⅢ-tubulin 和 PLK1 的表达，这两种物质在肺部肿瘤中都很难用化学药物进行选择性抑制。首先，作者选择沉默人肺癌细胞中βⅢ-tubulin的表达，因为作者之前已经证明人βⅢ-tubulin同工型是肺癌的治疗靶点。对正位植入人类肺癌 H460 肿瘤的 SCID-米色小鼠反复雾化处理 star-βIII-tubulin siRNA 或 star-control siRNA 纳米颗粒，并在肿瘤细胞植入后二十天收获整个肺部。所有小鼠都能耐受治疗，没有呼吸困难或体重下降的迹象。 6. 星形-PLK1 siRNA 纳米粒子的气溶胶递送降低了 PLK1 蛋白的表达，并减少了同种异体小鼠肺肿瘤中肿瘤细胞的增殖为了研究雾化星型 siRNA 纳米粒子是否能在包含由免疫细胞与肿瘤细胞混合而成的复杂肺肿瘤微环境的同种异位小鼠肺癌模型中抑制靶蛋白的表达，C57BL/6 小鼠在生长 LLC 肺肿瘤后 16 天收获全肺，重复雾化处理星型-PLK1 siRNA 或星型对照 siRNA 纳米粒子。所有小鼠都能耐受治疗，没有出现呼吸困难或体重下降的迹象。星形-PLK1 siRNA 纳米粒子的气溶胶递送显著降低了 LLC 肺部肿瘤中 PLK1 蛋白的表达。同时，磷酸化组蛋白 H3 阳性细胞的数量也增加了 2.3 倍，而磷酸化组蛋白 H3 阳性细胞是有丝分裂停止的标志；Ki67 阳性细胞的数量也明显减少，Ki67 是细胞增殖的标志。 至此，这篇文章就介绍完啦，总结一下：作者首先深入探讨了星形聚合物-siRNA纳米粒子的制备和其在肺癌细胞中的基因沉默活性；第二部分，详细描述了这些纳米粒子如何通过气溶胶递送积累到肺部；第三部分，阐述了星形-siRNA纳米粒子在小鼠的肺部肿瘤中沉默βIII-微管蛋白和Polo-Like Kinase 1 (PLK1)的表达的能力；第四部分，展示了这种沉默如何延迟肿瘤的生长，提供了一个新的治疗策略的概念验证。全篇知识点丰富，为作者提供了一个新的肺部肿瘤治疗策略的研究方向，对于从事肿瘤研究的小伙伴来说，这是一个不容错过的学习机会哦！ |
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