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1.肠道微生物衍生的 TMAO 推动了 PDAC TME 中的免疫活化并降低了肿瘤生长为了研究肠道微生物组如何影响 PDAC 的生长和免疫反应，作者确定了使用抗生素甲硝唑改变肠道微生物组对小鼠肿瘤生长的影响。作者使用从基因工程 KPC 小鼠（5）中分离出的同源 C57BL/6 PDAC 细胞建立了 PDAC 小鼠正位模型。在小鼠正位注射 PDAC 细胞后的第 0 天，将甲硝唑通过饮用水提供给肿瘤小鼠，并在第 21 天评估肿瘤生长情况。甲硝唑能明显增加肿瘤负荷。 2.膳食胆碱或肠道微生物TMA裂解酶可表征服用TMAO的影响胆碱是循环中 TMAO 的主要来源。因此，作者研究了增加膳食中的胆碱是否会表征 TMAO 的抗肿瘤作用。作者将 PDAC 小鼠置于正常饲料中补充 1%（重量/重量）胆碱（即胆碱含量比基线增加 10 倍以上），或在肿瘤细胞移植后第 0 天开始食用正常对照饮食。三周后，使用非靶向代谢组筛选法评估血清中代谢物的变化。与对照组相比，补充胆碱的小鼠体内 TMAO 和 TMA 含量的增加是唯一的明显变化；这些变化与 PDAC 负担的明显减少有关。对肿瘤浸润免疫细胞的流式细胞术分析表明，补充胆碱可产生与服用 TMAO 相似的免疫刺激效应。3.TMAO促使PDAC免疫浸润发生抗肿瘤转录变化为了深入了解 TMAO 在肿瘤浸润免疫细胞中诱导的转录变化，作者对荧光激活细胞分选（FACS）分选的 CD45 + 免疫细胞进行了 10x Genomics Chromium 液滴单细胞 RNA-seq (scRNA-seq)。作者评估了来自对照组和经 TMAO 处理的 PDAC 小鼠的 10,000 个 CD45 + 细胞。经过质量控制（QC）和过滤后，scRNA-seq 分析确定对照组有 7793 个细胞，TMAO 处理组有 8706 个细胞。细胞聚类采用统一表层逼近和投影（UMAP）图显示，多个免疫细胞亚群分为 14 种具有不同转录特征的细胞类型。 4.TMAO 诱导巨噬细胞获得免疫刺激表型为了了解 TMAO 在肿瘤环境中对巨噬细胞的影响，作者将 BMDM 暴露于无 TMAO 或有 TMAO 的 PDAC 肿瘤培养基（TCM）中 8 小时，并进行了 RNA-seq 分析。单独添加 TCM 会导致显著变化（FDR< 0.05) in expression of >9300 个基因）。例如，中药增加了免疫抑制基因（包括 Arg1、Cd274 和 Tgfβ1）的表达，同时降低了促炎症反应基因（包括 Clec12a、IL-12rb2 和 Ciita）的表达。针对调节因子的 IPA 发现，NFE2L2、MYC、HIF1A 和 ATF4 的表达增加，IRF3、IRF7 和 STAT1 的表达减少。这表明，用中药体外调节巨噬细胞会导致转录组发生变化，而这些变化正是免疫抑制性 TAMs 的特征。
5.TMAO 可增强 I 型 IFN 反应，并以 I 型 IFN 依赖性方式产生抗肿瘤作用为了验证 TMAO 诱导 I 型 IFN 激活的观察结果，作者用已知的 I 型 IFN 通路激活剂，包括 ISD（IFN 刺激 DNA）或 poly(dG:dC)（聚脱氧鸟苷-脱氧胞苷酸），在没有或有 TMAO 的情况下刺激 BMDM 8 小时，并通过反转录聚合酶链反应（RT-PCR）评估转录本的变化。BMDM 对 ISD 和 poly(dG:dC) 的反应是 I 型 IFN 反应基因的表达增加。TMAO 诱导 Irf7、Irf5 和 Ifnα1 对 ISD 和 poly(dG:dC) 的表达，但只诱导 Ifnβ1 对 poly(dG:dC) 的表达。在 ISD 刺激下，TMAO 还增加了活化标记物（包括 CD86、MHCII 和 PDL1）的表面表达，以及 MHCII + PDL1 + 巨噬细胞的百分比。这些结果表明，TMAO 增强了 I 型 IFN 反应，并可能通过刺激 I 型 IFN 通路促进获得免疫刺激巨噬细胞表型。 6.TMAO 直接改变巨噬细胞的表型，使其能够支持 T 细胞反应并减轻 PDAC 负担用 TMAO 处理巨噬细胞会显著改变基因转录，这一观察结果表明 TMAO 可能会增强巨噬细胞驱动 T 细胞增殖的能力。作者将 OT-I T 细胞（SIINFEKL 特异性 CD8 + T 细胞）与同源肽脉冲 DC 共同培养了 3 天，培养过程中存在用 TCM ± TMAO 诱导 24 小时的 BMDM。使用中药引物是为了模拟肿瘤环境的免疫抑制作用。 7.在人类巨噬细胞中观察到了 TMAO 的促炎效应作者接下来测试了 TMAO 是否会诱导人类巨噬细胞产生促炎表型。作者将人单核细胞衍生巨噬细胞（HMDM）暴露于由人胰腺癌细胞系 PANC-1 或 Capan-2 生成的中药中，无论是否存在 300 μM TMAO。在中药刺激的巨噬细胞培养物中加入 TMAO 会显著增加促炎基因的表达（PANC-1 衍生的中药包括 IFNR1、IL-6、CCL-5、TNFA 和 IL-1B，Capan-2 衍生的中药包括 IFNB、IL-6、CCL-5、IL-1B 和 NF-κB），并显著降低抗炎基因 IL-10 的表达。 8.TMAO 使 PDAC 对检查点免疫疗法敏感，并提高了肿瘤小鼠的存活率为了更好地探索 TMAO 的治疗潜力，作者使用了皮下肿瘤模型，并在小鼠肿瘤达到 3 至 5 毫米大小时开始治疗。与对照组相比，接受 TMAO 或 TMA 或抗 PD1 加抗 Tim3 组合治疗的小鼠的肿瘤负荷明显降低。当作者将 TMAO 与抗-PD1 加抗-Tim3 或 TMA 与抗-PD1 加抗-Tim3 结合使用时，肿瘤抑制效果明显增强；结合使用还能提高存活率。总之，这些结果表明，胆碱代谢物 TMAO 或 TMA 与 ICB（抗 PD1 加抗 Tim3）结合使用时，可改善 PDAC 对 ICB 的反应性和肿瘤小鼠的存活率。
9.TMA 产菌水平和 CutC 基因表达与癌症患者生存率的提高和对抗癌药物 PD1 的反应有关肠道和肿瘤中的微生物会影响宿主的生理机能、癌症生长和治疗反应（7、9、11、29）。Riquelme 等人（7）认为，PDAC 长期存活者（LTS）肿瘤中富集的几种细菌可预测存活率的提高。与短期 PDAC 幸存者（STS）或健康对照组的粪便微生物群移植（FMT）相比，将这些 LTS 的粪便微生物群移植到 PDAC 小鼠体内可获得抗肿瘤免疫效果。有研究认为，肿瘤中的细菌从肠道转移到胰腺中，并在胰腺中定植，从而影响肿瘤微生物组的组成和抗肿瘤免疫（7、8）。 来个小总结：文章首先深入探讨了肠道微生物群所产生的代谢物TMAO在免疫激活中的作用；接下来，作者详细描述了TMAO如何增强对胰腺癌的抗肿瘤免疫反应；在第三部分，作者了解到了TMAO是如何通过增强I型干扰素(IFN)途径来产生其抗肿瘤效应的；而在第四部分，文章描述了TMAO与免疫检查点阻断剂结合时的治疗效果及其未来的应用潜力。这篇文章知识内容丰富，为作者提供了许多生信分析的新视角，对于从事免疫研究的朋友们来说，这是一篇不容错过的好文章！ |
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