【国家自然科学基金】p53在骨质疏松症中的作用机制及中医药干预研究进展

本文引用文献格式：刘沛,蒋宜伟,周玉英,等.p53在骨质疏松症中的作用机制及中医药干预研究进展[J].中国骨质疏松杂志,2023,29(7):1021-1026.  

基金项目：国家自然科学基金(82160916，81760873)；兰州市科技计划项目(2021-1-95)；甘肃中医药大学2019年教学研究与改革立项项目（YBXM-29）

作者：刘沛1  蒋宜伟1，2*  周玉英2  张夏阳1  麻永胜1  宋重东1  郝东昶1  秦大平1

作者单位：

1.甘肃中医药大学，甘肃 兰州 730000

2.甘肃中医药大学附属医院，甘肃 兰州 730000

*通信作者：

蒋宜伟，Email：[e-mail]

正  文  

      骨质疏松症（osteoporosis，OP）作为一种常见的代谢类骨病，以骨密度降低，骨组织微观结构恶化，骨量减少，骨稳态被破坏导致骨的强度变弱而易引起骨折为主要特点[1]。据我国相关流行病学调查研究显示，在40岁以上人群中，OP的患病率男性为5.0%，女性为20.6%，因OP引起的椎体骨折，男性发生率为10.5%，女性为9.7%[2]，OP俨然成为威胁人类健康的公共问题。最新研究表明，基因在OP的发生发展中发挥着重要作用，不同基因通过不同途径参与OP的发病机制[3]。

      p53是所有癌症类型中突变频率最高的基因，p53基因的失活对肿瘤的形成起着重要的作用。其作为一种关键转录因子，在响应各种应激信号的同时，直接或间接参与调控众多基因，涉及DNA修复、细胞凋亡、衰老以及代谢等[4]。OP作为一种多因素引起的疾病，在其发病机制中有多种基因与信号通路参与其中，在通过对与OP相关基因的生物信息学分析显示，p53基因与OP的相关性高居首位[5]，p53可能在OP的发生发展中起着核心作用。近年来中医药对于OP的治疗效果显著，优势明显，因此笔者将对p53在OP中的作用机制以及中医药靶向调节p53治疗OP的研究进展作一综述。

1 p53影响骨稳态在OP中的作用机制

      人体骨骼的健康依赖于骨稳态的维持，骨稳态受到由成骨细胞介导的骨形成和破骨细胞介导的骨吸收共同调控，如果骨吸收与骨形成之间的平衡被打破，骨吸收的速度快于骨形成时则会引起骨量的丢失从而引起OP[6]。p53能够通过抑制成骨细胞的增殖，促进成骨细胞凋亡，减少骨形成，使骨稳态失衡，进而导致OP的发生发展。

      成骨细胞来源于骨髓中的间充质干细胞（bone mesenchymal stem cells，BMSCs），BMSCs主要经Wnt/β-catenin以及骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）途径向成骨分化，然后由成骨转录因子Runx2、Osterix（Osx）及同源转录因子DLX5等激活后进一步转移[7]。研究发现，p53调控成骨细胞的分化是通过miRNAs介导的，miRNAs作为小型非蛋白编码RNA，是基因表达的关键转录后调控因子，p53能够调控多个miRNA的表达，而miR-34家族成员是最普遍的p53诱导的miRNA，其中miR-34b/c通过抑制Cyclin D1、CDK4和CDK6抑制成骨细胞增殖，并通过抑制SATB2抑制成骨细胞的终端分化[8]。Runx2、Osx被认为是miR-34b的结合位点，在p53缺失的情况下，Runx2、Osx在miRNA中的表达明显上调[9]。p53除了通过miRNAs介导调控成骨细胞分化外，还通过与Runx2之间相互作用抑制Runx2的转录活性，p53还能够抑制Osx和DLX5与DNA的结合以及协同转录作用，当p53突变使p53蛋白高度表达时，则干扰DLX5-RUNX-OSX转录网络的功能[10]，使转录因子的活性被阻止，成骨细胞的分化能力受到影响，骨形成减少，最终引起OP等骨骼类疾病。由此可见，当p53过表达或者缺失的情况下，都会对骨稳态产生影响。

2 p53影响骨代谢在OP中的作用机制

      OP作为一种慢性骨代谢类疾病，骨代谢平衡紊乱是引起OP的重要原因，主要表现为骨形成和骨吸收两者之间的转换紊乱或者异常，骨代谢的异常同样会引起骨稳态的失衡。骨代谢受到多种因素的调控，其分子机制较为复杂，涉及信号通路的传导、炎症因子释放、细胞死亡等多个方面。在OP中，p53则通过不同途径调控骨代谢。

2.1 p53调控骨代谢相关信号通路

      骨代谢相关信号通路的转导异常会引起成骨细胞和破骨细胞的增殖及分化的异常、骨密度的降低而引起OP。p53则通过对骨代谢相关信号通路的调控而影响骨重塑，而Wnt/β-catenin、OPG/RANKL/RANK及 BMP/Smads信号通路则是调节骨代谢的主要三条关键信号通路[11]。

2.1.1 p53与Wnt/β-catenin信号通路：Wnt/β-catenin作为骨代谢中的经典信号通路，成骨细胞的分化主要受Wnt/β-catenin信号传导调节。p53在Wnt/β-catenin传导的间充质祖细胞(mesenchymal progenitor cells，MPCs)成骨分化的过程中起到负向调节作用，研究发现β-catenin缺陷的MPCs中p53活性提高，并且它们成骨能力的缺陷通过仅仅从其中删除p53而完全恢复，表明p53是负向参与Wnt/β-catenin促成骨的关键节点[12]。同时p53对Wnt/β-catenin具有正向调节作用，p53蛋白诱导的核蛋白2(TP53INP2)则通过激活Wnt/β-catenin调节人脂肪干细胞（human adipose stem cells，hASCs）的成骨分化，敲除TP53INP2 的hASCs细胞中β-catenin水平降低，而在使用Wnt信号激动剂后，TP53INP2的蛋白水平增加，结果表明Wnt/β-catenin途径和TP53INP2可能形成正反馈环，或者Wnt/β-catenin途径激活TP53INP2表达[13]。所以p53可能在对Wnt/β-catenin途径所介导的成骨分化中具有双向调节作用。

2.1.2 p53与OPG/RANK/RANKL信号通路：OPG/RANK/RANKL信号通路是调节骨代谢平衡的重要通路，在调节破骨细胞的分化和功能中起到关键作用，RANKL是破骨细胞生成所需的配体，RANK是RANKL介导的破骨细胞生成所必需的受体，OPG是RANKL的诱饵受体并与RANK竞争[14]，OPG通过阻断RANKL与RANK的结合来抑制RANKL介导的破骨细胞生成来抑制骨吸收[15]。p53负向调控OPG/RANK/RANKL信号通路，在对不同p53状态小鼠的研究中发现，具有p53缺陷的小鼠的OPG/RANKL比率显著增加，OPG/RANKL的比率是破骨细胞活化的重要指标，并且p53与BMSCs 中产生的OPG负相关，在p53缺失的情况下BMSCs中OPG的表达增加[16]，而OPG的缺失则将导致骨吸收中破骨细胞活性增加而引起OP。 

2.1.3 p53与BMP/Smads信号通路：BMP/Smads信号通路调节骨代谢平衡主要在于影响骨形成方面，在BMSCs向成骨细胞分化这一过程中，BMP家族的BMP2与靶细胞上的Ⅰ型和Ⅱ型丝氨酸/苏氨酸激酶受体结合，激活Smad-1,5,8介导的转导通路，最终激活成骨相关转录因子Runx2和Osx，并通过增加碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）的活化和骨钙素等基因的表达来促进骨形成[17-18]。BMP信号的传导受p53负调控，p53能够抑制BMP诱导的转录，其通过与Smad-1,5,8直接物理相互作用调节BMP/Smads的活性[19]。此外，BMP通过改变成骨细胞释放的RANKL或OPG水平来改变RANKL与OPG比值进而影响破骨细胞的分化[20]，p53通过对BMP/Smads的负向调控，抑制Runx2和Osx的转录活性，减少成骨细胞的分化，打破成骨与破骨之间的平衡。

2.2 p53调控炎症因子

      炎症因子同样参与骨代谢中，OP是由于衰老、雌激素水平下降导致体内免疫系统的低度活化、产生大量的炎症介质而引起，在炎症微环境下，促炎因子的释放进而影响骨代谢平衡而引起OP。IL-1、IL-6、IL-8以及TNF-α等因子的增加通过多种机制促进骨吸收，增强NF-κB受体激活剂配体RANKL的表达，增加破骨细胞的分化、活化和存活，并抑制成骨细胞存活[21]。正常情况下，p53可以抑制炎症反应，而p53的功能丧失或者突变时会导致过度的炎症反应，研究发现，p53的活化诱导了IL-6、IL-8和TNF-α的表达[22]。因此，当p53突变或者功能丧失，其失去对炎症反应的抑制导致过量促炎因子的释放将可能使骨代谢紊乱，促进骨吸收，降低骨形成，而导致OP的发生发展。

2.3 p53调控铁死亡

      铁死亡被定义为一种铁依赖性的程序性细胞死亡形式，铁过载和活性氧（reactive oxygen species，ROS）的累积则作为铁死亡的显著特征，并且是OP发生的重要危险因素，实验发现，铁过载和ROS累积诱导了成骨细胞的铁死亡，抑制成骨分化和矿化从而损害成骨细胞的功能，导致骨重塑障碍[23-24]。此外，在炎症微环境的情况下促进了铁死亡，例如在类风湿性关节炎中，IL-6增加细胞内铁水平，降低了铁蛋白的表达，并诱导滑膜成纤维细胞的铁死亡[25]。铁死亡又促进了大量炎症因子的释放，正常情况下谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）可以通过下调TNF-α介导的NF-κB信号通路来减弱炎症反应并抑制炎症细胞因子，研究发现，在GPX4失活的肠上皮细胞的上清液中发现了IL-6、TNF-α等多种炎症细胞因子[26-27]。

      p53作为铁死亡的关键调节因子，对铁死亡具有双向调节作用，一方面，p53可以通过抑制溶质载体家族7成员11（SLC7A11）的表达或通过促进亚精胺/精胺N1-乙酰转移酶1（SAT1）和谷氨酰胺酶2（GLS2）的表达来增强铁死亡。另一方面，p53通过直接抑制二肽基肽酶4（DPP4）活性或通过诱导细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂1A（CDKN1A/p21）表达来抑制铁死亡[28]。由于铁代谢在铁死亡中的重要性，p53通过铁氧还蛋白还原酶（FDXR）调节铁代谢，FDXR是p53靶基因，p53诱导FDXR的转录表达。同时，FDXR促进p53 mRNA翻译，通过细胞中的铁调节蛋白2（IRP2）增加p53蛋白水平[29]。此外，p53还通过氨基酸代谢、脂质代谢等途径调节铁死亡[30]，因此中医药靶向调节p53从而诱导破骨细胞铁死亡或者是抑制成骨细胞的铁死亡，改善骨代谢平衡，将可能在防治OP上将成为一种新的策略。

3 中医药靶向p53防治OP的研究进展

      OP属于中医学中“骨痿、骨痹”的范畴，早在《素问·痿论》中载有：“肾气热，则腰脊不举，骨枯而髓减，发为骨痿。”中医学认为，肾虚是OP发生的根本，并与脾虚、肝肾阴虚和血瘀有关[31]。中医药在防治OP上具有独特的优势，常用的中药多为滋补肝肾、活血化瘀、补脾益气之类，且单味中药及其有效成分药理作用明确，靶向度高，中药复方则注重君臣佐使，灵活配伍，提高疗效，体现了中医学整体观念和辨证论治的原则。已有大量研究表明，中医药可通过不同途径调节p53达到防治OP的效果。

3.1 中药活性成分

       近年来研究发现中药治疗OP的主要活性成分包括黄酮类、苷类等化合物。中药活性成分可以通过信号通路传导等多种途径间接或直接调节p53达到防治OP的目的。表1列举了一些常用中药活性成分及其所属的类别、作用机制等。

3.2 中药提取物

       淫羊藿善补肾壮阳，祛风除湿，女贞子善滋补肝肾之阴，两药合用行阴阳并补之功。研究发现，淫羊藿-女贞子配伍的中药提取物能够可通过上调抗凋亡因子Bcl-2的表达，下调p53的表达，从而维持凋亡与抗凋亡间的平衡，维持骨骼稳态。此外，两者配伍还通过调控TGF-β/Smads信号通路来促进骨形成，纠正骨代谢失衡状态达到防治OP的作用[43]。贺自克等[44]研究发现，杜仲水提物通过Nur77/MDM2/p53途径对BMSCs产生影响，其通过上调Nur77蛋白表达，从而促进下游MDM2蛋白表达，增强p53蛋白的泛素化，进而促进BMSCs增殖和成骨分化，为防治OP开辟新的视野。

3.3 中药复方

      在辨证论治思想的基础上，中药复方遵从君臣佐使的配伍原则将不同性味、归经的中药优化组合在一起使它们发挥出各自最大的功效，对疾病产生最优的治疗效果，由于对于中药复方调控p53防治OP的相关实验验证较少，本文在此仅仅总结了杜仲腰痛丸，壮骨补髓方，独活寄生汤。

3.3.1 杜仲腰痛丸：杜仲腰痛丸以杜仲、元胡、土鳖虫等药物组成，具有活血消肿，滋补肝肾之功。研究发现，杜仲腰痛丸可以逆转p53过表达对骨形成的抑制作用并且显著增加ALP、OCN和Runx2表达，表明其可以通过调控p53来促进骨形成，提高OP患者骨密度，改善骨代谢失衡的状态[45]。

3.3.2 壮骨补髓方：壮骨补髓方由地黄、牛膝、淫羊藿、杜仲、黄芪、茯苓等组成，具有补肾健骨，益气健脾的功效。其通过提高Bcl-2的表达，抑制p53来抑制成骨细胞凋亡，并激活PI3K/Akt信号通路促进成骨分化从而改善OP的骨质流失[46]。

3.3.3 独活寄生汤：独活寄生汤是由独活、桑寄生、牛膝、杜仲、秦艽、防风、肉桂、人参、茯苓等组成。具有祛风湿、止痹痛、益肝肾、补气血之功效。研究发现[47]，在经过独活寄生汤干预后的大鼠相较于模型组caspase-3表达降低，Bcl-2表达升高，p53和p21蛋白表达均降低，独活寄生汤通过p53信号途径抑制细胞的凋亡和衰老，从而发挥了关键的抗OP作用。

中药复方在防治OP上具有独特的优势，可根据OP患者的病因病机，病理过程等灵活组方、优化组方，目前大量网络药理学分析显示，p53是中药复方防治OP关键靶点，例如金匮肾气丸[48]、六味地黄丸[49]等此类的经典方剂，但是还需要通过具体的实验来验证其调节p53防治OP的作用机制。

4 结语与展望

      OP作为临床上常见的骨代谢类疾病，以骨稳态失衡，骨代谢紊乱，骨密度降低，骨量减少为特点，且容易引起脆性骨折。p53作为一种抑癌基因，对其的研究过多关注点在于其在肿瘤、癌症方面的作用机制，本综述发现，p53在OP的发生发展中起到不可忽视的作用，其通过多种途径打破骨吸收与骨形成之间的平衡影响骨重塑。此外，近年来铁死亡与OP之间的相关性是国内外研究的热点，而p53对于铁死亡又具有双向调节作用，通过p53诱导破骨细胞铁死亡，或者抑制成骨细胞细胞铁死亡在防治OP上值得进一步深入研究。中医药在治疗OP方面，无论是复方还是单体都具有独特优势，但是以p53为关键靶点来进行防治OP的研究较少，且研究方法较为单一，未来的学者应把临床与基础研究紧密结合起来，利用多学科、多技术对中医药靶向调控p53进行更为系统化的研究。

      综上，p53与OP的发生发展密切相关，p53可以通过多种途径促进OP的发生发展，中医药可以通过直接或者间接的途径调节p53而发挥抗OP作用，目前大量的分子对接技术及网络药理学研究发现不论是中药复方还是中药活性成分，p53都是其作为防治OP的关键靶标，但是缺少具体的体内或者体外实验进行验证，因此在未来中医药靶向p53防治OP的研究开展中需要更加深入的研究，充分发挥中医药抗OP的优势，这将对促进中医药现代化意义重大。(参考文献略）