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题目：Increasing amyloplast size in wheat endosperm through mutation of PARC6 affects starch granule morphology 刊名：New Phytologist 作者：Lara Esch, David Seung et al. 单位：John Innes Centre, Norwich Research Park, Norwich, NR4 7UH UK 日期：10 July 2023    01 摘要  对植物中淀粉颗粒形态的测定知之甚少。小麦胚乳的淀粉质体含有大的盘状A型颗粒和小的球形B型颗粒。 为了研究淀粉体结构对这些不同形态类型的影响，我们在硬粒小麦（Triticum turgidum）中分离到一个质体分裂蛋白PARC6缺陷的突变体，该突变体在叶片和胚乳中都有巨大的质体。 突变体的胚乳淀粉体比野生型含有更多的A型和B型颗粒。突变体在成熟谷物中增加了A型和B型颗粒的大小，其A型颗粒具有高度异常的浅裂表面。这种形态缺陷在晶粒发育的早期阶段已经很明显，并且在聚合物结构和组成没有改变的情况下发生。尽管质体大小较大，但突变体的植株生长、粒径、数量和淀粉含量没有受到影响。有趣的是，PARC6同源物ARC6的突变并没有增加质体或淀粉颗粒的大小。我们认为TtPARC6可以通过与PDV2相互作用来补充被破坏的TtARC6功能，PDV2是一种外质体包膜蛋白，通常与ARC6相互作用以促进质体分裂。 因此，我们揭示了淀粉体结构在小麦淀粉颗粒形态发生中的重要作用。 02 技术路线  Peach (Prunus persica L. Batsch cv. Hujingmilu) fruits Plant transformation Grain and plant morphometrics Starch purification, granule morphology and size distribution Total starch content, starch composition, amylopectin structure and Rapid Visco Analysis Protein localisation in Nicotiana benthamiana Protein extraction and immunoblotting 03 主要结果 3.1 小麦ARC6和PARC6基因的鉴定 我们首先在硬粒小麦在ARC6和PARC6中有缺陷，以测试它们是否增加了胚乳中的淀粉体大小。使用Blastp对抗面包小麦（Triticum aestivum）参考基因组，我们鉴定了编码在第6组染色体上的ARC6的三个推定同源序列：TaARC6-A1（TraesCS6A02G066200.3）、TaARC6-B1（Traescs6B02G0089500.2）、TaARC6-D1（TraescSU02G0117700.1）；以及编码在第2组染色体上的三个假定的PARC6同源物：TaPARC6-A1（TraesCS2A02G555400.1）、TaPARC6-B1（TraesCS2B02G588400.1）和TaPARC6-D1（Traes CS2D02G559100.1）（图1a）。 我们使用系统发育树分析，分别将这些基因确认为拟南芥ARC6和PARC6的直向同源物。在硬粒小麦参考基因组，TaARC6的同源序列对应于TtARC6-A1（TRITD6Av1G015630.3）和TtARC6-B1（TRITD6Bv1G022070.1），其预测的氨基酸序列与面包小麦序列相同。硬粒小麦中的PARC6对应于TtPARC6-A1（TRITD2Av1G286550.2）和TtPARC6-B1（TRITD2Bv1G255410.2）。这些初级基因模型预测的氨基酸序列与面包小麦中相应的同源序列分别为86.6%和97.1%。我们的分析证实，ARC6和PARC6基因在植物中都是高度保守的，硬粒小麦和面包小麦的每个基因都有一组同源序列。
图1 Ttparc6硬粒小麦突变体的生长表型。 （a） 面包小麦中TaPARC6-A1、TaPARC6-B1和TaPARC6-D1初级转录物的基因模型示意图。 （b） 8周龄的Ttparc6双突变体（Ttparc6-1-aabb）、相应的野生型（WT）分株（Ttparc 6-1-aabb。 （c）成熟Ttparc6突变体植物的单株分蘖数（分蘖数）。 （d–h）Ttparc6突变体幼苗第三叶中叶肉细胞叶绿体的图像。 3.2 Ttparc6和Ttarc6突变体的表型分析 为了分离Ttparc6和Ttarc6突变体，我们使用了小麦TILLING突变体资源，其特征是硬粒小麦品种Kronos的外显子组捕获测序、EMS诱变突变体。我们获得了在TtPARC6-A1中携带过早终止密码子代替Gln503的系Kronos1265（K1265）和在TtPARC6-B1中携带过早停止密码子代替Gln456的系Krnos2369（K2369）（图1a）。将K1265和K2369品系进行杂交，形成Ttparc6-1和Ttparc6-2品系，这两个品系是由使用不同植物的两个独立杂交事件引起的。KASP基因分型用于鉴定F2和F3代中A和B基因组突变（aaBB、aaBB和aaBB）的纯合单突变体和双突变体以及相应的“野生型片段”（aaBB）。 我们还将Ttparc6-2双突变体与栽培品种Kronos中的转基因淀粉体报告系杂交，以达到两个目的：首先，该转基因系未暴露于EMS诱变，因此是回交的合适遗传背景，以去除Ttparc 6-2中不希望的背景突变。其次，该品系携带单个玉米泛素（ZmUbi）启动子驱动的转基因，该转基因编码用OsWaxy转运肽靶向质体基质的mCherry蛋白，使淀粉质体可视化。使用KASP和基于PCR的基因分型来分离每个PARC6基因型的回交（BC）个体（BC AABB、BC AABB、BC AABB和BC AABB），以及携带报告基因转基因。 在我们的生长条件下，Ttparc6的单突变体或双突变体系在生长、发育和分蘖数量方面与其野生型对照相同（图1b、c）。为了检测突变是否影响叶片中叶绿体的大小，我们对从最年轻的完全发育的幼苗叶片中分离的叶肉细胞进行了共聚焦显微镜检查。与野生型对照相比，回交和非回交双突变体系的叶绿体大小都显著增加（图1d–h）。在单个突变体（Ttparc6-1 AAbb、Ttparc6-1-AAbb、Ttparc 6-BC AAbb和Ttparc6-BC AAbb）中，叶绿体大小在视觉上与野生型对照无法区分。 由于Ttparc6双突变体的叶绿体大小增加，但生长似乎正常，我们使用气体交换分析检查了它们的光合效率。在光响应曲线中，与野生型对照相比，回交和非回交双突变体都显示出光合作用速率（a）略有下降的趋势，但在环境（280 μmol m−2 s−1）或强光（2000 μmol m−2 s−1）显示突变体和野生型对照之间没有差异。突变体和野生型对照在最大羧化速率方面也没有显著差异。尽管与回交的野生型片段（Ttparc6-BC-aabb）相比，回交的双突变体（Ttparc 6-BC-aabb）中的最大电子传输（Jmax）显著降低，但与野生型相比并不显著。非反向交叉Ttparc6-1-aabb双突变体的Jmax也与其野生型对照没有差异。因此，我们没有检测到Ttparc6突变对测量的光合参数的任何一致影响。 使用与TtPARC6类似的方法，我们还分离出TtARC6的两个同源同源物中有缺陷的突变体，穿过系Kronos3404（K3404）和Kronos2205（K2205），以引入过早终止密码子代替TtARC6-A1中的Gln631和TtARC6-B1中的Trp647。与上述小麦Ttparc6突变体和拟南芥arc6突变体不同，叶绿体大小不受Ttarc6突变的影响。因此，我们将胚乳淀粉的分析重点放在Ttparc6突变体上。 3.3 Ttparc6突变体具有正常的粒径、数量和产量 我们检查了从Ttparc6突变体中收获的谷物（图2a、b）。回交和非回交双突变体以及单突变体的单株总产量与其野生型对照没有显著差异（图2c，S3m）。Ttparc6突变对粒径、重量和总淀粉含量也没有一致的影响（图2d，S3o，p）。非反向杂交Ttparc6双突变体和单突变体的平均千粒重（TGW）与野生型对照没有显著差异（图2d）。然而，回交的Ttparc6-BC-aabb双突变体的TGW显著高于野生型对照（相对于WT增加24%）（图2d）。这种回交双突变体的粒径参数也显著高于野生型分体和野生型（面积、宽度和长度分别增加了15%、10%和6%）（图2f–h）。由于这些粒重和粒径的增加仅在回交双突变体中观察到，而在非回交双突变中没有观察到，它们要么不是由Ttparc6突变直接引起的，要么是非回交系中的其他突变抑制了粒径的增大。
图2 Ttparc6硬粒小麦突变体的种子表型。 （a，b）每个基因型10个代表性成熟谷物的照片 （c）每株收获的总谷物重量（单位：g）。 （d）千粒重（TGW）（单位：g）。 （e）总淀粉含量，单位为%（w/w）。 （f–h）测量为种子面积（f）、宽度（g）和长度（h）的粒度参数（h）秩的单向方差分析 3.4 Ttparc6突变体增加了胚乳中的淀粉颗粒大小 我们从Ttparc6突变体的成熟颗粒中纯化了淀粉颗粒，并检测了淀粉颗粒的大小和形态（图3a、b）。与野生型和相应的野生型片段相比，Ttparc6双突变体具有显著改变的粒度分布。突变体中的A型颗粒峰向较大的颗粒直径移动；B型颗粒峰值不仅向较大的颗粒尺寸移动，但也具有较大的峰面积。我们将对数正态分布拟合到B型颗粒峰值，并将正态分布与a型颗粒峰值拟合，以得出a型和B型颗粒的平均直径，以及B型颗粒含量（以B型颗粒形式存在的总淀粉体积的百分比）。两种双突变体（aabb）基因型的A型颗粒的平均直径均显著大于其相应的野生型对照（Ttparc6-1 aabb增加15.1%，Ttparc6-BC aabb增加21.9%）（图3c）。虽然在两个Ttparc6-1-aabb双突变体中都向更大的B型颗粒尺寸转变，但只有回交的双突变体基因型B型颗粒的平均直径显著增加（Ttparc6-1 aabb增加27.3%，Ttparc6-BC-aabb增加43.5%）（图3d）。然而，我们在Ttparc6-1-aabb和Ttparc6-BC-aabb双突变体中检测到B型颗粒含量的大幅显著增加，在双突变体基因型中为67%至73%，而在野生型及其野生型片段中为35%至45%（图3e）。Ttparc6双突变体和对照之间存在的淀粉颗粒数量（每毫克淀粉）没有显著差异（图3f）。 有趣的是，我们还观察到Ttparc6突变对颗粒大小分布的显著剂量效应。Ttparc6单一同源异型突变体的颗粒大小分布发生了中间变化，相关的大小参数（A型颗粒直径、B型颗粒直径和B型颗粒含量）介于双突变体和野生型片段之间。 然后，我们使用扫描电子显微镜（SEM）检查了纯化淀粉的淀粉颗粒形态。与使用库尔特计数器进行尺寸量化的结果一致，我们观察到非常大的A型颗粒。令人惊讶的是，双突变体中的大多数A型颗粒具有明显的叶形、皱折的外观（图3g–k）。使用偏振光显微镜，大多数非常大的A型颗粒都有一个被破坏的马耳他十字架，有些没有十字架（图3l–p）。在单个同源异型突变体的A型颗粒中观察到类似的叶形表面结构和改变的双折射。
图3 来自Ttparc6硬粒小麦突变体成熟粒的纯化淀粉颗粒的尺寸分布和形态。 （a，b）Coulter计数器分析的尺寸分布图。 （c–e）在（a，B）中给出的颗粒尺寸分布数据中，通过对B型颗粒峰值的对数正态分布和对a型颗粒峰的正态分布进行拟合获得的颗粒尺寸参数。 （c）A型颗粒直径（单位：μm）。 （d）B型颗粒直径（单位：μm）。 （e）按体积百分比计的B型颗粒含量。 （f）在库尔特计数器上定量的每毫克（mg）淀粉的颗粒数。 （g–k）来自成熟谷物的淀粉颗粒的扫描电子显微镜。 3.5 Ttparc6突变体的颗粒形态在整个颗粒发育过程中发生改变 为了确定Ttparc6突变体中颗粒大小和形态的变化是如何发生的，我们在发育中的12、16和21个晶粒中检测了Ttparc6-2双突变体的颗粒 开花后第二天（DAF；图4，5）。在12DAF时，在B型淀粉颗粒起始之前，Ttparc6-2 aabb突变体的A型颗粒在大小上与野生型的相似（图4a、5a）。然而，即使在这个时间点，双突变体也已经在A型颗粒形态上发生了强烈的变化，这与在成熟颗粒中观察到的变化相似（图4e，f，m，n）。B型颗粒的合成是由16DAF引发的。此时，A型颗粒的直径明显大于野生型（增加5%），B型颗粒的含量也大于野生型颗粒（增加98%；图4b、5c）。双突变体中的A型颗粒保持明显的叶形，而B型颗粒是圆形的，与野生型相似（图4g，h，o，p）。与野生型对照相比，Ttparc6-2 aabb突变体中A型颗粒直径、B型颗粒直径和B型颗粒含量的差异随着颗粒发育的进行而增加（图4c、d、5）。双突变体的成熟颗粒具有与图4（d，k，l，s，t）和5的实验中观察到的相似的粒度分布。
图4 Ttparc6-2硬粒小麦突变体发育过程中纯化淀粉颗粒的粒径分布和形态。 （a–d）发育过程中纯化淀粉颗粒的尺寸分布（12，16，21 开花后第二天-DAF）和成熟的谷物。 （e–l）纯化淀粉颗粒的扫描电子显微镜。 （m–t）纯化淀粉颗粒的偏振光图像。 3.6 Ttparc6突变体的颗粒形态在整个颗粒发育过程中发生改变 为了确定Ttparc6突变体中颗粒大小和形态的变化是如何发生的，我们在发育中的12、16和21个晶粒中检测了Ttparc6-2双突变体的颗粒 开花后第二天（DAF；图4，5）。在12DAF时，在B型淀粉颗粒起始之前，Ttparc6-2 aabb突变体的A型颗粒在大小上与野生型的相似（平均直径为14.4和14.0 μm）（图4a、5a）。然而，即使在这个时间点，双突变体也已经在A型颗粒形态上发生了强烈的变化，这与在成熟颗粒中观察到的变化相似（图4e，f，m，n）。B型颗粒的合成是由16DAF引发的。此时，A型颗粒的直径明显大于野生型（增加5%），B型颗粒的含量也大于野生型颗粒（增加98%；图4b、5c）。双突变体中的A型颗粒保持明显的叶形，而B型颗粒是圆形的，与野生型相似（图4g，h，o，p）。与野生型对照相比，Ttparc6-2 aabb突变体中A型颗粒直径、B型颗粒直径和B型颗粒含量的差异随着颗粒发育的进行而增加（图4c、d、5）。双突变体的成熟颗粒具有与图4（d，k，l，s，t）和5的实验中观察到的相似的粒度分布。
图5 发育中的Ttparc6-2硬质小麦籽粒的淀粉粒度参数和B型颗粒含量。 （a–c）在图4所示的颗粒尺寸分布数据中，通过对B型颗粒峰值的对数正态分布和对a型颗粒峰的正态分布进行拟合获得的颗粒尺寸参数。 （a） a型颗粒直径（单位：μm）。 （b） b型颗粒直径（单位：μm）。 （c） B型颗粒的体积百分比含量。 此外，我们使用共聚焦显微镜检查携带荧光淀粉体报告基因转基因的Ttparc6-2 aabb双突变体的分段中的淀粉体（如前一节所述）。我们对Ttparc6-2的横截面进行了成像 +ccTPmCherry aabb双突变体和Ttparc6-2 +在16DAF下的cTPmCherry AABB野生型片段。与野生型分体相比，双突变体中的淀粉样体大小显著增加，并且突变体中的许多淀粉样体含有一个以上的大A型颗粒（图6）。在这些淀粉体中，A型颗粒似乎被基质空间分隔开（图6i，j）。未观察到野生型分离物中的直链淀粉体含有一种以上的A型颗粒（图6g，h）。然而，与TEM图像一致，在野生型和突变体中，在一个囊泡状淀粉体室中都有多个B型颗粒（图6g–j）。我们证实了cTPmCherry的过表达不会影响Ttparc6-aabb表型，这证实了在有和没有报告基因的品系之间，植物生长、粒径、淀粉含量和粒径分布是可比较的。
图6 Ttparc6硬粒小麦突变体发育中籽粒的直链淀粉体结构。 （a–f）发育中的籽粒胚乳切片的透射电子显微镜（TEM）图像 开花后第二天（DAF）。 （g–j）在稳定过表达淀粉体标记cTPmCherry的品系中，在16DAF下对发育中的籽粒的胚乳切片进行共聚焦激光扫描成像 3.7 Ttparc6双突变体的淀粉组成与野生型硬粒小麦淀粉相似 我们测试了Ttparc6突变体的高度改变的淀粉颗粒形态是否是由淀粉聚合物结构和组成的变化引起的。尽管在回交和非回交的双突变体和一些单突变体中都观察到相对于野生型增加的直链淀粉含量，但与野生型分离物对照相比，双突变体中的差异并不显著，因此不太可能由Ttparc6突变引起。Ttparc6双突变体中支链淀粉的链长分布与野生型和相应的野生型片段的链长分配无法区分。此外，快速粘度分析（RVA）显示粘度或糊化特性没有一致的差异，这表明淀粉颗粒的晶体结构在突变体中不太可能改变，因为结晶度的变化通常与糊化温度的改变有关。总之，淀粉颗粒形态的改变不太可能由淀粉组成或聚合物结构的差异引起。 3.8 TaPARC6与PDV1和PDV2旁系相互作用 与Ttparc6突变体相比，Ttarc6双突变体在叶片中没有显示出叶绿体大小的增加。Ttarc6双突变体（Ttarc6-aabb）的胚乳淀粉颗粒大小分布也与野生型分离物（Ttarc6-aabb）相似。这增加了小麦质体分裂机制与拟南芥质体分裂机制不同的可能性，因为arc6突变没有强烈的影响。或者，过早终止突变在我们的小麦Ttarc6突变体中的位置（在A和B同源同源物中；图S2）可能允许产生具有残余功能的截短蛋白。然而，TtARC6和拟南芥AtARC6的氨基酸序列的比对表明，TtARC6系中任何推定的截短蛋白都将终止在与先前表征的截短的AtARC6蛋白（AtARC6ΔIMS）相似的位置，缺失C端膜间间隙区。在拟南芥中，这种截短极大地损害了ARC6的功能，因为它去除了AtARC6与AtPDV2的C端相互作用位点，从而破坏了质体的分裂。因此，我们分析了小麦ARC6和PARC6蛋白是否能够分别与小麦PDV2和PDV1直向同源物相互作用，如先前在拟南芥中对同源蛋白所观察到的那样。我们使用Blast和系统发育树分析鉴定了PDV1和PDV2的相应小麦直向同源物（图S9b）。在维管植物中，早期的重复产生了PDV1和PDV2这两种蛋白质。有趣的是，在Poodae中，存在PDV1的额外复制（导致PDV1-1和PDV1-2），这也暗示了与拟南芥相比，小麦质体分裂机制可能存在差异。 我们克隆了小麦ARC6、PARC6、PDV1-1、PDV1-2和PDV2的A基因组同源序列。用黄色荧光蛋白（YFP）C-末端标记并在N中瞬时表达的TaPARC6和TaARC6。使用共聚焦显微镜，我们观察到TaPARC6-A1-YFP定位于路面细胞中质体中的不同点（图7a–c）。这些点状物更多地定位在叶绿体的外围，并且不与叶绿素自发荧光共生，表明它们可能在叶绿体包膜处（图7a–c）。在叶绿体外围也观察到TaARC6-A1-YFP，但没有形成点状（图7d-f）。TaPDV1-1-A1、TaPDV1-2-A1和TaPDV2-A1是外膜蛋白并且靶向叶绿体并且通过C末端序列而不是N末端转运肽锚定在外膜中。因此，我们用N-末端绿色荧光蛋白（GFP）标记TaPDV1-1-A1、TaPDV1-2-A1和TaPDV2-A1。当在烟草中瞬时表达时，我们不能定位GFP-TaPDV1-1-A1。 然而，GFP-TaPDV1-2-A1明显定位于叶绿体，尽管荧光强度较弱（图7g–i）。GFP-TaPDV2-A1定位在叶绿素荧光周围，表明可能定位在叶绿体包膜上。 在共免疫沉淀实验中，TaPARC6-GFP与RFP-TaPDV1-1相互作用，也与RFP-TaPDV1-2和RFP-TaPD-2弱相互作用（图7m）。然而，TaARC6-HA仅与GFP-TaPDV2相互作用（图7n），如先前对拟南芥所示。因此，在小麦中，除了PDV1-1和PDV1-2之外，TaPARC6还可能通过与PDV2相互作用来补偿TaARC6功能的损失。
图7 小麦TaPARC6、TaARC6和TaPDV亚型的定位和共免疫沉淀分析。 （a–l）本氏烟草表皮细胞中瞬时表达的AtUbi:TaPARC6-A1-YFP、CaMV35S:TaARC6-A1-YFP、CaMV35S:GFP-TaPDV1-2-A1和CaMV35S:GFP-TaPDV2-A1的图像。使用共聚焦激光扫描显微镜获取图像。黄色荧光蛋白（YFP）和绿色荧光蛋白（GFP）荧光显示为黄色和绿色，而叶绿素自发荧光显示为青色。 （m） 使用抗红色荧光蛋白（RFP）珠进行免疫沉淀（IP）测定，以测定烟草叶片中瞬时共表达的TaPARC6 YFP与RFP-TaPDV1-1、RFP-TaPD-1-2和RFP-TaPDV2之间的相互作用。用免疫印迹法检测RFP和GFP抗体。 （n） 使用抗GFP珠进行免疫沉淀（IP）测定，用于在烟草叶片中瞬时共表达的TaARC6 HA和GFP-TaPDV1-1、GFP-TaPD-1-2和GFP-TaPDV2。使用HA（血凝素）标签和GFP抗体的免疫印迹来检测蛋白质。 04 结论  我们的研究结果通过证明A型和B型淀粉颗粒的数量和大小取决于淀粉质体的大小和可获得的基质体积，从而推进了当前小麦淀粉颗粒形成的模型（图8）。虽然这些发现是小麦科特有的双峰型淀粉颗粒的特有发现，但它们也突出了与其他物种可能的共同特征。在拟南芥质体分裂突变体中，增大的叶绿体中淀粉颗粒的数量随着基质体积的增加而增加，使得每个基质体积的颗粒数量保持与野生型相似，并且颗粒大小不受影响。
图8 小麦胚乳发育过程中野生型和Ttparc6双突变体的淀粉质体和淀粉颗粒结构模型。 05 原文获取 原文链接： https:///10.1111/nph.19118 PDF获取： https://nph.onlinelibrary./doi/epdf/10.1111/nph.19118 |
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