 Human MutT Homolog 1（MTH1）是一种核苷酸焦磷酸酶，可水解氧化的核苷酸以防止其在氧化应激下错误结合到DNA中，但关于MTH1在血小板中的表达和功能作用尚不清楚。 2023年8月，徐州医科大学血液病研究所乔建林/徐开林/曾令宇团队在Nature Communications（IF 16.6）上发表了题为“MTH1 protects platelet mitochondria from oxidative damage and regulates platelet function and thrombosis”的研究论文，揭示了血小板线粒体氧化损伤修复的新机制。中科新生命为其提供了磷酸化蛋白质组学检测的技术服务。  研究材料 MTH1flox/flox小鼠、PF4-CRE小鼠和野生型小鼠以及人的血小板 技术路线 步骤1：MTH1敲除小鼠体内出血和血栓检测； 步骤2：MTH1敲除小鼠体外血小板功能检测； 步骤3：MTH1敲除小鼠血小板线粒体氧化损伤检测； 步骤4：MTH1敲除小鼠磷酸化蛋白组学检测； 步骤5：MTH1缺陷降低了mtdna编码基因的表达。 研究结果 1. MTH1在血小板线粒体中表达，其缺乏会损害体内止血和血栓形成 为了探索MTH1是否在血小板内表达，研究者基于WB证实MTH1在血小板内表达，并基于分数免疫印迹法和免疫电镜分析证实MTH1定位于线粒体。为进一步研究MTH1的功能，构建了巨核细胞/血小板特异性MTH1敲除小鼠，发现MTH1缺乏会损害血小板止血功能，影响动脉和静脉血栓形成（图1）。  图1 MTH1在血小板线粒体中表达，在体内调节止血和血栓形成 2. MTH1缺乏抑制GPCR介导的血小板聚集、钙动员和线粒体ATP生成 进一步体外评估MTH1对血小板功能的影响，发现MTH1缺失不影响胶原相关多肽（CRP）（GPVI受体的激动剂）介导的血小板聚集或ATP释放。但可抑制依赖于凝血酶（GPCR受体的激动剂）介导血小板聚集、ATP产生、整合素激活和钙动员等相关的血小板功能（图2）。  图2 MTH1缺乏损害GPCR依赖性血小板聚集、钙动员和线粒体ATP产生 3. MTH1缺失血小板中线粒体DNA氧化损伤增加 然后，研究者评估了MTH1缺乏是否会导致线粒体DNA(mtDNA)的氧化损伤，发现，MTH1缺失显著增加了凝血酶诱导的血小板线粒体氧化损伤，进一步的分析发现，线粒体ROS生成依赖GPCR诱导并且钙信号通路参与线粒体ROS生成，进而引起线粒体氧化损伤（图3）。  图3 MTH1缺失血小板中线粒体DNA氧化损伤增加 4. MTH1缺失血小板中蛋白磷酸化调控失调 研究者进一步通过磷酸化蛋白质组学揭示MTH1缺乏所导致的血小板功能改变的分子调控机制。KEGG分析发现MTH1缺陷血小板中差异磷酸化蛋白主要富集在血小板活化、MAPK和磷脂酰肌醇信号通路，而凝血酶处理后的MTH1-/血小板中p38 MAPK和AKT的磷酸化水平显著降低，PLCβ3 (Ser1105)和RhoA (Ser188)的磷酸化水平显著升高，表明MTH1缺失损害了PLCβ3活性和RhoA激酶信号传导。 为了找到凝血酶介导的MTH1缺乏症的特异性作用，作者重点分析了线粒体磷酸化的功能：发现在MTH1缺失的血小板中，Slirp和Slc25a1磷酸化显著下调，而这两个蛋白，一个参与调控线粒体代谢（Slc25a1），另一个参与调控线粒体蛋白合成（Slirp）（图4）。  图4 凝血酶刺激后MTH1缺陷血小板中蛋白磷酸化异常 5. MTH1敲除显著下调MT-CO1的表达 考虑到MTH1缺乏诱导mtDNA氧化损伤和ATP生成，以及slrp(调节线粒体蛋白合成)磷酸化降低，因此下一步评估了MTH1缺乏是否影响mtDNA编码蛋白的表达，作者发现凝血酶刺激后的MTH1缺陷血小板中细胞色素c氧化酶1(MT-CO1)的蛋白表达水平显著降低。与此一致的是MT-CO1基因表达也降低，主要原因是MT-CO1 DNA中鸟嘌呤含量高于其他mtDNA，使得该基因在MTH1缺陷血小板中DNA复制过程更容易受到氧化损伤。此外也验证了MTH1缺失导致的血小板磷酸化蛋白谱发生变化是受到线粒体的影响（图5）。  图5 凝血酶刺激后，MTH1缺陷降低了mtDNA编码基因的表达 6. MTH1在人血小板中发挥相同作用 最后作者分析了MTH1在人血小板中的作用。通过添加MTH1抑制剂TH588，发现其显著降低了凝血酶诱导的血小板功能，并增加了血小板线粒体氧化损伤，综上所述，这些数据表明MTH1可能在人类血小板功能中也发挥了同样的作用（图6）。  图6 抑制人血小板MTH1可降低凝血酶介导的血小板功能 小结 本研究基于表型实验和磷酸化蛋白组学证明了MTH1在小鼠血小板线粒体中的功能：MTH1在血小板线粒体中表达，其缺失会损害GPCR依赖性血小板功能和血栓形成。这也暗示着MTH1可能是预防血栓性疾病的潜在治疗靶点。 中科优品推荐 【中科新生命】提供全方位、不同形式的磷酸化修饰组： 4D-Labelfree磷酸化、4D-DIA磷酸化、TMT磷酸化、PRM磷酸化以及磷酸化与蛋白组、磷酸化与代谢组、磷酸化与O-GlcNAc糖基化的联合分析，更有特色的激酶-药靶分析。欢迎感兴趣的老师前来咨询。 << 滑动查看下一张图片 >> |
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