CRISPR/Cas9文库筛选流程

CRISPR/Cas9 基因编辑技术的全基因组筛选具有高通量和高效率的特点，已被广泛应用于基因功能、转录调控等研究，为研究疾病机理和药物开发等提供了依据。

CRISPR/Cas9文库筛选基本流程

1. sgRNA文库的设计与合成：确定待研究的基因列表，选择合适的sgRNA设计软件（如CRISPR-FOCUS、CHOPCHOP、CRISPR library designer（CLD）、Cas-designer等）。为确保基因能够被编辑，每个基因一般设计4-6个sgRNA。

2. 慢病毒载体的构建及感染宿主细胞：将sgRNA文库进行慢病毒包装，并以较低的病毒感染复数转导至Cas9表达细胞系，确保每个细胞只进入1个病毒，从而实现每个细胞只有一个基因被编辑。

3. 阳性或阴性筛选：根据研究目的不同，CRISPR高通量筛选分为阳性筛选和阴性筛选。阳性筛选指施加一定的筛选压力（如药物），经文库扰动后，仅有抗性的细胞存活，这类细胞被编辑的基因可能是细胞存活抑制基因。阴性筛选是选取不同筛选时间点的存活细胞，通过比较细胞内sgRNA丰度差，获得缺失的sgRNA，分析其所对应的基因，这些基因可能是细胞存活必须基因。

4. 高通量测序与生信分析：从筛选的细胞亚群中提取基因组DNA，然后对sgRNA的靶向区域进行PCR扩增，随后对这些区域进行高通量测序，统计sgRNA相对丰度。根据筛选前后的sgRNA丰度变化确定sgRNA是被富集还是消耗，从而确定sgRNA靶向的基因与表型之间的关系（抑制存活或存活必须）。

5. 验证候选基因：用 CRISPR/Cas9 技术筛选出若干个候选基因后，需要通过一系列方法进行验证，从而鉴定出调控特定表型的功能基因。首先需分析其脱靶情况，若脱靶标位点在外显子内可能导致假阳性结果。然后使用 CRISPR/Cas9技术进行单个基因敲除，通过筛选单克隆细胞构建候选基因敲除细胞系，在基因分型和免疫染色确认基因已被敲除后，检测候选基因敲除对病毒复制的影响，同时可通过遗传互补试验确定其作用是否由基因敲除所致。