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结果： 以往的研究表明，CRC的显著特征是增强的糖酵解活性。因此，这种代谢特征导致乳酸产生显著增加，乳酸是组蛋白乳酸化的重要底物。由于缺乏乳酸化谱来确认CRC中全局乳酸化的存在，而在其他癌症中，乳酸化已被证明存在于多种蛋白质中，并且对肿瘤的发生和发展至关重要[15, 32]，作者在这里探讨了CRC中乳酸化的存在及其临床意义（图1）。首先，作者对CRC样本进行验证，发现癌组织中全局乳酸化水平升高，与相邻正常组织相比（图2A）。这一观察结果在CRC细胞系与正常结肠上皮细胞系NCM46比较时得到进一步证实（图2B）。此外，作者利用免疫荧光法评估CRC细胞系中的全面乳酸化状态。结果表明，赖氨酸乳酸化不仅局限于细胞核，而且还存在于细胞质中（附加文件1：图S1A-F）。这一观察进一步表明，全球乳酰化不仅限于与组蛋白相关的蛋白质，而且超越了转录调控的范畴，强调了其在多种蛋白质修饰中的普遍存在。为了评估全球乳酰化的潜在临床意义，作者对一组全面的组织微阵列进行了免疫组织化学染色，揭示了与正常组织相比，CRC组织中全球乳酰化水平显著增加（图2C），并且随着阶段的增加，乳酰化水平也增加（图2D）。此外，作者的研究表明，较高的全球乳酰化水平与早期（I-III期）和晚期（IV期）患者的不良预后有关（图2E，F）。通过单变量和多变量Cox回归分析，乳酰化水平始终被确定为CRC的独立预后因子（图2G，H）。统计学上，高乳酰化组表现出更高的复发率和远处转移率，同时伴随着更晚期的肿瘤阶段（图2I-K）。这些发现强调了乳酰化作为结直肠癌预后标志物的潜在重要性，揭示了它与疾病进展和预后的关联。进一步探索乳酰化在结直肠癌中的分子机制可能揭示出治疗这种具有挑战性的恶性肿瘤的新途径。
从单细胞转录组中鉴定结直肠癌相关的乳酸化相关基因（LRGs）为了识别与乳酰化修饰最相关的基因，作者对单细胞测序数据进行了深入分析。经过质量控制，作者精心选择了46,286个高质量细胞进行后续分析。每个样本的表达谱在附加文件1: 图S2A中进行了可视化描述。主成分分析（PCA）降维图表明细胞周期之间没有明显的差异，如附加文件1: 图S2C所示。该研究涵盖了10个样本，明显可见每个样本内的细胞分布保持了极高的一致性，表明样本之间没有显著的批次效应。随后，采用降维技术，特别是t-分布随机邻域嵌入（t-SNE），成功将所有细胞聚类成22个不同的群组，如图3A所示。气泡图被用来可视化各种细胞类型的特征标记基因，如附加文件1: 图S2F所示。通过t-SNE（图3B）和UMAP（附加文件1: 图S2G、H）可视化了11个特定细胞群集的分布。根据中位数AUC分数，将所有细胞分配到高乳酰化AUC组和低乳酰化AUC组，并为其分配一个AUC分数（图3C）。显然，具有更多乳酰化相关基因（LRGs）的细胞倾向于以红色为主的免疫细胞，主要是NK细胞、T细胞和B细胞（图3D）。随后，作者鉴定了高乳酰化组和低乳酰化组之间的879个差异表达基因（DEGs）（附加文件2：表S5）。此外，相关性分析揭示了与乳酰化活性最强相关的基因（图3E），作者选择了与乳酰化活性高度相关的前100个基因，称之为CORGs（附加文件2：表S6）。总之，这项单细胞研究通过重叠的DEGs和CORGs，确定了与乳酰化活性最强相关的918个乳酰化相关基因（LRGs）。作者进一步通过基因集变异分析（GSVA）、基因本体（GO）和疾病本体（DO）分析，在单细胞水平上研究了LRGs相关的分子特征。分析表明，乳酰化在促肿瘤通路中起着重要作用，如“MYC”，“PI3K-AKT-mTOR”，“HYPOXIA”，并与免疫相关通路相关，如“INTERFERON_GAMMA_RESPONSE”，“IL2_STAT5_SIGNALING”和“TGF_BETA_SIGNALING”（图3F-H，附加文件2：表S8-S10）。
鉴于LRG与促肿瘤途径之间的相关性，作者对其在预测CRC预后中的作用产生了兴趣。由于scRNA-seq数据的样本量有限，作者选择进一步分析TCGA队列以提取LRG预后标志。最初，单变量Cox回归分析确定了与CRC相关的67个候选基因，如热图所示（图4A）。为了精选基因，作者采用了LASSO分析（图4B），结果鉴定出23个具有非零LASSO回归系数的基因，包括RBM17、TERF2IP、AP2M1、NR1H2、MED10、HSPA1B、ARL4C、LY6E、ARPC1B、HSPB1、SLC2A3、RBM3、LGALS4、PTTG1、H2AFY、HMGN2、LEPROTL1、LITAF、ACTG1、RAB5C、METTL9、UBE2I、SFPQ。这些基因构成了一个名为LRG评分（LRGS）模型的预测模型（图4C）。LRGS模型是根据每个基因的分配系数构建的，揭示了一个独特的模式，其中最初的11个基因与较高风险相关，而随后的12个基因与较低风险相关。这个综合模型将这些个体基因的预测能力整合起来，提供了一个精细的工具来评估结直肠癌的预后。风险评分模型根据以下方程进行计算：
为了进一步符合这些乳酸化基因在肿瘤微环境（TME）中构成的LRGS的分布，作者重新分析了单细胞RNA测序数据。结果显示，HSPB1、ACTG1、SFPQ、RBM3、LY6E、AP2M1、RAB5C、MED10、RBM17、METTL9、LGALS4在上皮细胞和内皮细胞中表达较高，而LEPROTL1、TERF2IP在T细胞和NK细胞中表达较高，ARL4C、ARPC1B、SLC2A3、H2AFY、LITAF在单核巨噬细胞中表达较高（图5A）。此外，NR1H2、PTTG1在所有细胞群中检测到的水平较低。单细胞水平的23个LRG的KEGG富集分析还表明，LRG与吞噬体、抗原处理和呈递等相关（图5B，附加文件2：表S12）。随后，作者转向批量RNA转录组进行进一步分析。LEPROTL1，SLC2A3，LY6E，ARL4C，AP2M1，RAB5C，LITAF与免疫评分呈正相关，而LGALS4，SFPQ，RBM3，UBE2I，H2AFY，RBM17，PTTG1则与之相反，根据估计分析结果。从CIBERSORT分析中可以看出，SLC2A3，LY6E整体上与免疫细胞浸润呈负相关，而LITAF，ARL4C，SLC2A3和LEPROTL1与几乎所有免疫细胞显著相关（附加文件1：图S3A-E）。随后，作者对各种细胞系中标志基因的表达水平进行了全面评估。值得注意的是，与正常细胞系NCM460相比，CRC细胞系（如HCT116，HCT15，HCT8，SW620，SW480，SW1116，RKO和DLD1）中RBM17，TERF2IP，AP2M1，NR1H2，MED10，HSPA1B，ARL4C，LY6E，ARPC1B，HSPB1的RNA表达水平显著升高（图5C）。此外，为了加强这些基因表达变化在CRC中的重要性，作者进一步对临床组织中的水平进行了详细研究（图5D）。此外，作者的调查还扩展到一些核心风险基因的蛋白质表达水平，包括AP2M1、LY6E、ARL4C、ARPC1B和TERF2IP，通过免疫组化分析结直肠癌组织和相邻正常组织中的蛋白质表达水平，与RNA水平一致（图5E-I，附加文件1：图S3F）。这一额外的证据层次强调了这些基因在结直肠癌中的相关性。
为了探索高风险组和低风险组之间转录组和遗传变异的分子意义，并深入了解与高风险组低生存率相关的生物学过程，作者研究了TCGA队列中LRGS模型的基因组异质性。作者对LRGs的突变景观进行了检查，并与经常突变的基因如APC、TP53、TTN和KRAS进行了相关性分析（图6A、B），发现LRGs并没有承载大量的突变负担，但与促肿瘤途径（如“RTK-RAS”、“WNT”、“Hippo”、“PI3K”、“MYC”）以及与免疫相关的途径（如“TGF-β”）密切相关（图6C）。随后，进行了功能富集分析，以揭示对高风险患者预后不良的过程。在基于GO基因集的GSEA分析中，高风险组显示出“血管生成”、“顶部连接”、“凝血”和“上皮间质转化”等富集（图6D）。相反，低风险组在途径如“E2F靶点”、“MYC靶点”、“氧化磷酸化”、“G2M检查点”和“MTORC1信号传导”方面显示出富集（图6E）。GSVA分析显示，基于风险评分在122个通路中存在差异表达。值得注意的是，高风险组与“NOTCH信号通路”、“WNT信号通路”、“ECM受体相互作用”、“FOCAL ADHESION”和“ETHER脂质代谢”等通路呈正相关，这些通路都促进了肿瘤生长（图6F，附加文件2：表S13）。此外，作者还进行了关键通路活性与LRG风险评分之间的相关性分析，揭示了高风险组和低风险组之间的明显特征，进一步验证了高风险与上皮间质转化、血管生成、缺氧、Notch信号传导等的关联，并在免疫信号传导中发挥了重要作用，如IL2-STAT5信号传导、TGFβ信号传导、IL6 Jak stat信号传导、IFNγ信号传导等（图6G）。
最近的研究强调了炎症微环境在CRC发展中的关键作用，特别是免疫和基质细胞与肿瘤细胞的活化状态和相互作用[33, 34]。据报道，乳酸化水平与免疫信号紧密相关，并有助于肿瘤环境的重塑[35]。在这里，作者使用七种不同的算法进行了全面分析，一致地显示低风险肿瘤中T细胞浸润增加（图7A）。此外，通过CIBERSORTx对22种免疫细胞景观的评估显示T细胞亚型存在显著差异，CD4记忆细胞的浸润较低，而Treg和巨噬细胞在高LRG评分组中浸润较高（图7B）。此外，作为关键的抗原呈递细胞，树突状细胞在低风险组中普遍存在。单样本基因集富集分析（ssGSEA）再次证实了这些发现，强调了低风险组中强大的抗肿瘤免疫反应（图7C）。探索风险评分与免疫治疗生物标志物之间的关系，作者观察到高风险组中免疫检查点基因（ICGs）如PD-1和PDCD1的表达升高，暗示了潜在的治疗靶点（图7D）。通过多重免疫组织化学（mIHC）的验证，确认了ARL4C、ARPC1B和TERF2IP在肿瘤组织中的突出表达，并且它们的表达与CD8 T细胞的存在呈负相关（图7E, E,F)。这项全面的分析突显了乳酸化水平与免疫细胞浸润之间的复杂相互作用，加强了癌症与肿瘤微环境之间的关系，从而为结直肠癌的免疫治疗提供了潜在的见解。
在疾病进展和免疫治疗反应中，免疫浸润的关键作用以及乳酸化对TME的重塑影响的基础上，作者研究了作者的预后模型在接受ICI治疗的CRC患者中的预测能力。利用TIDE评分，作者观察到高风险组的排斥评分、功能障碍评分和总体TIDE评分显著增加（图8A、B）。这表明高风险患者可能存在免疫逃逸的潜力，可能导致ICI治疗的有效性降低。亚类映射（Submap）结果进一步表明，低风险组可能对PD-1治疗更敏感（Bonferroni校正p < 0.05）（图8C）。此外，作者验证了多个免疫治疗数据集的效果，IMvigor数据集显示低风险组具有更好的生存结果（图8D）和对抗PD-L1免疫治疗的改善反应（图8E）。这种趋势在不同阶段持续存在，低风险患者在I或II期（图8F）和III或IV期（图8G）中的预后更好。在GSE78220数据集中得到了一致的结果，进一步证实了低风险组对免疫疗法的良好反应（图8H，I）。这项全面分析强调了作者预测结直肠癌患者免疫疗法结果的预后模型的潜力。
精确预测的一个整合了LRG评分和临床参数的Nomogram 在追求LRG评分的其他临床适用性方面，作者进行了独立和多重预后分析，以确定影响CRC预后的潜在因素，并确认LRGR是CRC的独立风险因素（图9A，B）。通过可视化模型基因与各种临床特征之间的相关性，作者观察到高风险组中不利的T分期、N分期、M分期和临床分期值的较高患病率，而与年龄和性别没有显著关联（图9C-F，附加文件1：图S4）。利用TCGA-CRC数据集，作者精心制定了一个预测性的评分表，将风险评分与关键的临床病理参数（如T分期和N分期）结合起来，预测1年、3年和5年的生存率（图9G）。由于M分期信息样本的稀缺性，作者在评分表中排除了M分期。校准曲线证实了评分表在1年、2年和3年预测中与实际结果的一致性（图9H）。决策曲线分析（DCA）证明了评分表在临床效益方面相对于仅使用LRGS的优越性（图9I）。时间依赖的AUC进一步证实了诺模图相对于风险评分和其他传统临床指标具有更优越的预测性能（图9J）。 
寻找高LRGS组的潜在治疗药物 为了为高LRGS的CRC患者确定潜在的治疗选择，作者的研究采用了对化学药物和靶向药物的全面分析。利用癌症治疗反应门户网站（CTRP）和混合物中同时进行相对抑制（PRISM）数据集的敏感性数据，作者确定了针对高LRGS组的有前景的药物。从CTRP数据集中，GANT-61、NSC23766和PRIMA-1被确定为潜在的候选药物（图10B），而PRISM数据集则突出了罗米地平、洛拉替尼、替地唑磷酸盐等药物（图10C）。这些药物的AUC值在高LRGS组中显著较低，表明更好的敏感性，详细的药物功能请参见附加文件2：表S14。此外，作者评估了两个风险组中四种化疗药物的半数抑制浓度（IC50）。在低风险组中，顺铂、吉西他滨和紫杉醇的IC50值显著低于高风险组，表明低风险患者可能获益。相反，吉非替尼在高风险组中显示出较低的IC50值，使其成为该组的更合适选择（图10D-G）。与LRGS相关的9个基因，包括ARPC1B、TERF2IP、ARL4C、UBE2I、LGALS4、SFPQ、HMGN2、LEPROTL1和H2AFY，与特定化疗药物的敏感性相关（p < 0.05）（图10H）。这些基因包括LRGS中的三个风险基因，即ARPC1B、TERF2IP和ARL4C，以及六个保护基因，包括UBE2I、LGALS4、SFPQ、HMGN2、LEPROTL1和H2AFY。ARPC1B和UBE2I与多种药物具有广泛的关联。例如，ARPC1B的表达增加与CRC患者对达布拉非尼、维姆拉非尼、恩可拉非尼、ABT-199和塞卢替尼的敏感性增强相关。类似地，UBE2I的表达增加与奈拉巴林、羟基脲、天冬氨酸酶、克拉布林和胞嘧啶的敏感性增加相关。在风险基因中，TERF2IP在与奈拉巴林、洛莫斯汀、异环磷酰胺和达沙替尼的关联中排名第二。这些发现表明LRGs与癌症治疗中药物敏感性之间存在复杂的相互作用（附加文件2：表S15），从而为临床使用提供更多方向。
总结 总之，作者的研究首次揭示了乳酰化对CRC的临床预后的显著影响，并确定了一组在单细胞水平上高度指示乳酰化活性的基因。这一开创性的发现不仅引入了一种新的预后指标，用于识别预后不良的CRC患者，还提供了潜在的治疗靶点，并为CRC患者的分子机制提供了深入的见解。通过采用这种多维度的方法，作者的研究显著扩大了可用的选择范围，提供了前所未有的洞察力，以最大限度地提高CRC治疗的疗效。
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