2022-01-03原创:医学界血液频道
急性淋巴细胞白血病(Acute Lymphoblastic Leukemia,ALL)是一种B或T细胞来源的淋巴母细胞在骨髓内异常增生的恶性肿瘤性疾病。异常增生的原始细胞在骨髓聚集并抑制正常造血功能,同时也可侵及骨髓外的组织。
主要表现为肝脾和淋巴结肿大、贫血、出血及继发感染等。ALL的全面、正确分型是准确、及时治疗的前提。
为了帮助大家更好地了解ALL免疫学分型以及流式分析在ALL诊疗中的应用,高博流式创新研究院系列培训课程第8期由来自高博诊断中心流式细胞研究室喻新建主任分享《ALL WHO分型及流式分析》精彩课程,具体内容如下。
关于ALL的一些事实
在课程伊始,喻新建主任介绍了ALL流行病学、发病特征和检测指标相关的基本信息,以便于我们对ALL有整体的了解。
简而言之,儿童比成人常见,B系比T系常见,B系比T系预后好。
大多数ALL属于B系,T-ALL只占儿童病例的10-15%和成人病例的25%。与B-ALL不同,T-ALL患者不能根据重现性细胞遗传学异常进行风险分层和治疗干预。B-ALL治疗效果好于T-ALL,但T-ALL预后随着使用强化化疗有显著改善。
ALL与淋巴母细胞淋巴瘤(LBL)的区分要点是根据原始细胞在骨髓或血液中的比例区分(25%以上诊断为ALL)。B-ALL多见于儿童,75%的病例小于6岁;B-LBL占LBLs的10%,年龄大多小于18岁。B-ALL常见于骨髓和外周血,髓外可见于中枢神经系统、肝脾淋巴结、睾丸;B-LBL最常见累及皮肤、软组织、骨、淋巴结,纵膈肿块少见。
T-ALL约占儿童ALL病例的15%,在青少年中比在年幼的儿童中更常见,在男性中更常见。T-ALL约占成人ALL病例的25%;T-LBL约占所有LBLs的85-90%,与对应的白血病一样,它最常见于青春期男性,但可以发生在任何年龄组。
T-ALL通常表现为高白细胞计数,并且通常伴有大的纵膈肿块或其他组织肿块,淋巴结和肝脾肿大很常见。T-LBL常表现为前纵膈肿块,常表现为快速生长,有时表现为呼吸急症,胸腔积液很常见。
对于给定的白细胞计数和肿瘤负荷,与B-ALL相比,T-ALL通常表现出正常骨髓造血功能的相对保留。T-ALL/LBL的淋巴母细胞在形态上与B-ALL/LBL的淋巴母细胞无法区分。不过ALL原始细胞的比例是以形态为准的。
与AML不同,对于确诊ALL所需的原始细胞比例没有公认的下限。但一般而言,当原始细胞小于20%时,应避免诊断为ALL。
B细胞和T细胞的分化过程
在讲到B细胞和T细胞的分化过程时,喻新建主任做了很形象的比喻:B细胞像女孩,一直养在家里深闺(骨髓)中成长;T细胞像男孩,从小就离家去远方的孤岛(胸腺)上修炼(图1~2)。
ALL的WHO分型
说到ALL WHO分型,可以用下面的时间轴(图3)和表格(表1)来概括一下演变历程。
首先可以确定诊断,明确疾病是正常反应性、增生性还是肿瘤性;其次可以确定白血病细胞的数量和疾病系别;第三可以帮助判断分层,包括:和预后的关联、与治疗方案相关的危险分组以及疾病的累及范围,如有无中枢神经系统(CNS)累及等;此外,流式免疫分型还可以帮助确定治疗靶点,以及监测治疗效果(检测MRD)。
对于ALL,和其它血液肿瘤一样,流式免疫分型判断异常细胞主要看以下几点:
▌ 流式免疫分型panel组成和ALL流式免疫分型基本抗体
ALL流式免疫分型的Panel主要由原始/幼稚细胞标记、系列特异标记、分化阶段标记、异常或跨系标记以及微小残留病(MRD)和/或靶向标记等部分组成。
高博诊断中心流式细胞实验室ALL流式免疫分型的基本抗体有:
B-ALL:CD19、CD20、CD22、cytoplasmic CD79a、CD34、CD38、CD10、CD58、CD81、CD123、CD13、CD33、CD45、TdT and HLA-DR
T-ALL:CD1a、CD2、CD3、cytoplasmic CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD10、CD13、CD33、CD34、CD45、CD56、CD38、CD117、MPO、TdT and CD99
国外一个比较有代表性的ALL Panel如下(表2)。
表2 ALL流式免疫分型panel示例(AIEOP-BFM协作组)
B-ALL的免疫表型及WHO2016亚型分类
在介绍了流式免疫分型在ALL中的应用基本知识后,喻新建主任分别从B-ALL和T-ALL两方面具体讲解了相关的免疫表型和亚型分类。
B系标记:CD19,cCD79a,cCD22。单个都不特异,但组合或强表达,强烈支持诊断
大多数表达:CD10,CD22,CD24,TdT
不恒定:CD20,CD34
CD45弱或阴性
可表达:CD13和CD33
组织标本:病理一般用CD79a或PAX-5。但CD79a在T-ALL也会阳性,不特异。PAX-5更常采用
顺便提一下,过渡型Pre-B可表达膜IgM,轻链不表达
克隆性的Ig轻链典型情况为阴性。阳性不排除B-ALL/LBL
特别关键的一点,是B-ALL细胞和正常B细胞前体的区别:
Hematogones(正常B细胞前体):表达CD10,连续,可重复
B-ALL细胞:抗体过表达或低表达。最常见的是CD10和CD58表达增加,CD38和CD45降低。少数情况下会出现CD10缺失,通常同时伴有CD24缺失和CD15表达。
成人多于儿童,25%vs 2-4%
表达:CD10,CD19,TdT
常有CD13,CD33阳性
Kit(CD117)阴性
成人患者CD25高度相关
BCL-ABL1者,罕见T-ALL
2、伴t(v;11q23.3);KMT2A(MLL)重排
最常见于<1岁的婴儿
成人随年龄而增加
临床:高白细胞,>100x109/L,CNS累及
CD19+CD10-CD24-(Pro-B表型)
CD15+
NG2+
3、伴t(12;21)(p13.2;q22.1);
不见于婴儿,常见于儿童,占年龄组的25%
成人罕见
CD19+CD10+CD34+
接近或完全缺失:CD9,CD20,CD66c
常有CD13+
白血病细胞染色体数目>50,通常<66
儿童常见,25%;成人不常见,7-8%
表达CD19,CD10,CD34
CD45阴性
白血病细胞染色体数目<46
CD10+CD19+。没有特别表型特点
预后差
6、伴t(5;14)(q31.1;q32.1);IGH/IL3
罕见,1%,儿童成人均有报道
可有嗜酸细胞增多
7、t(1;19);TCF3-PBX1(E2A-PBX1)
儿童比成人常见,6%
Pre-B表型:CD19,CD10,cIgM,
CD9 strong,CD34-
预后以前认为差,现在不确定,但易有CNS累及
WHO 2016分类里新增了两个暂定(provisional)亚类:
占10-25%
唐氏综合征,高频
CD19+CD10+,CRLF2高水平表达
预后差
图4 BCR-ABL1样B-ALL的CRLF2表达
21号染色体上RUNX1基因座的染色体内扩增
常见于儿童,特别是大儿童。低白细胞类型。发生率2%左右
表型无特殊
预后相对较差
使用RUNX1探针通过间期FISH很容易识别(诊断标准:至少5个RUNX1信号/细胞核)
T-ALL/LBL的免疫表型
在对T-ALL/LBL的免疫表型进行判断时,有以下几点需要注意:
T-ALL/LBL中的淋巴母细胞通常为TdT阳性,并不同程度地表达CD1a、CD2、CD3、CD4、CD5、CD7和CD8。
CD7和胞浆CD3通常呈阳性,但只有CD3被认为是系别特异性的。
CD4和CD8经常共表达,CD10可能呈阳性;然而,这些免疫表型对T-ALL不是特异性的,因为CD4和CD8双阳性也可见于T细胞幼淋巴细胞白血病;外周T细胞淋巴瘤(最常见的血管免疫母细胞性T细胞淋巴瘤)中CD10可阳性。
除了TdT和CD34外,CD1a和CD99可有助于判明T淋巴细胞的前体性质。
在大约10%的病例中观察到CD79a阳性。髓系相关抗原CD13和CD33之一或两者在19-32%的病例中表达。KIT(CD117)偶尔为阳性。
CD56表达虽然是NK细胞的特征,但并不排除T细胞白血病。
根据表达的抗原,T-ALL/LBL先前被分为四个阶段:(1)pro-T/Tl,(2)pre-T/T-ll,(3)皮质T/T-III和(4)髓质T/T-IV。许多以前归类为pro-T或pre-T的病例现在符合早期T细胞前体ALL(ETP-ALL)的标准。
那么作为WHO 2016新增的暂定亚型,ETP-ALL的免疫表型又是怎样的呢?
ETP-ALL是一种在儿童和成人中都发现的罕见肿瘤,约占儿童T-ALL病例的10-13%和成人ALL病例的5-10%。它的免疫表型情况是:表达CD7,不表达CD8和CD1a;一个以上的髓系/干细胞标志物CD34、KIT(CD117)、HLA-DR、CD13、CD33、CD11b和CD65阳性;表达胞浆或(在极少数情况下表达)胞膜CD3;可能表达CD2和/或CD4;CD5常为阴性,当阳性时,须<75%。
典型表型示例如下(图5)。有人建议将表达更亮或更均匀的CD5但满足ETP-ALL标准的白血病称为近似(near)ETP-ALL(图6)。
ALL MRD的流式分析
喻主任指出,通过LAIP(leukemia-associated immunophenotype)和DFN(difference-from-normal)的综合集成方法,可以最大限度地提高多色流式细胞术(MFC)MRD分析的准确性。
随后喻主任为我们介绍了进行ALL MRD流式分析时的注意事项。
首先在ALL MRD的诊断标准上,定义>0.01%为阳性。如果一个实验室做不到0.01%的灵敏度,那么这个实验室报告的MRD阴性未必是真阴性。需要强调的是,由于LOD(Limit of detection)通常要求最少20个细胞(BM和PB,脑脊液CSF可降至10-15个),LOQ(Lower limit of quantification)要求最少50个细胞,所以达到10-4(0.01%)的LOD和LOQ需要分析的最少细胞数量分别为20万和50万。
其次在检测选用标本方面,在AML和B-ALL中,骨髓(BM)抽吸物中的MRD水平往往比外周血(PB)中的MRD水平高一个对数级以上,而对于T-ALL,MRD水平在BM和PB接近。一般来说,BM抽吸物通常是MRD分析的首选样本。此外,提交第一管,体积不超过2毫升进行MRD分析可以减少PB污染(稀释)。BM样品应使用乙二胺四乙酸(EDTA)或肝素钠抗凝,及时处理(最好在收集后48小时内)。上样时则注意前后两管之间走一管鞘液以消除或最小化carryover污染。
第三,抗体组合通常包括CD34、CD38和CD45,可能包括TdT。对于B-ALL,还包括B细胞相关标志物(CD10、CD19、CD20、CD22、表面Ig和CD79a)和骨髓标志物(CD13和CD33)。为了在困难的情况下与hematogone的区分,也提出了其他标记,例如CD9、CD24、CD44、CD58、CD81和CD123。另外,CD81/CD58表达比率也可能有帮助。针对T-ALL MRD的panel通常包括CD1a、CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD10、CD45和CD56。包含CD56有时有助于识别T-ALL MRD,因为正常的未成熟T细胞不表达CD56。加入cCD3和未成熟标志(CD34和TdT)也可以提高T-ALL MRD分析的准确性。识别T-ALL MRD理论上比B-ALL容易,因为正常胸腺细胞(幼稚T细胞)通常不在胸腺外发现。不过,反应性成熟T亚群可能出现CD4/CD8双阳性T细胞的扩增。
具体的MRD panel设计可以参考借鉴下面的例子:
COG(Children’s Oncology Group)panels:
Tube1:CD20 CD10 CD38 CD19 CD58 CD45
Tube2:CD9 CD13/33 CD34 CD19 CD10 CD45
Tube1:CD16 cCD3 CD7-CD56 CD5 CD38 CD3 CD45
Tube2:CD8 CD48 CD5 CD16+56 CD3 CD4 CD7 CD45
EuroFlow BCP-ALL MRD kit:
MRD水平加上检测的LOD和LOQ;
白血病细胞的免疫表型;
细胞活力和样品质量(例如,潜在的血液稀释、细胞计数决定样品是否适合MRD检测);
对应的正常细胞的比例(例如,评估B-ALL MRD的样本中hematogone的百分比);
对于检测到MRD但低于LOQ的情况,可报告为:MRD低于LOQ,因此无法确定准确的定量;
对于检测到肿瘤细胞但低于验证LOD的情况,可报告为:可见肿瘤细胞但低于LOD,因此其意义尚不确定,建议密切临床随访。
CAR-T细胞治疗是一种非常有前景的肿瘤治疗方法,目前主要应用于血液肿瘤的治疗中。但同时,CAR-T治疗后会对流式MRD分析造成一定的挑战,主要体现在以下三点:
设门抗体的选择:系列标记的缺乏问题。CD19-CAR-T治疗后,新出现的肿瘤性B细胞克隆通常缺乏CD19的表达(30%~50%患者)。新的MRD检测方法会包括额外的B细胞设门标记,如CD22、CD24和/或CD79a;
CAR-T后肿瘤细胞的表型常会发生变化(Shift);
CAR-T治疗后MRD检测的示例见下(图7~图9)。
喻主任提到,如果遇到CAR-T治疗后流式MRD分析不能很好的鉴别是否有异常细胞时,最好同时结合分子生物学检测(如白血病融合基因,二代测序法的TCR或Ig基因克隆性重排等)。
课程最后,喻主任展望了ALL MRD流式分析的发展方向。他指出,传统分析方法在未来可能会显得捉襟见肘,人工智能的应用将会对ALL MRD的鉴别带来极大的帮助。已经有流式学者在做这方面的工作。但同时他也指出,目前人工智能在流式诊断上的应用尚未成熟,未来需要各位同仁的不懈努力。
高博诊断中心 医学检验科流式细胞实验室主任
主任医师,北京医科大学医学博士,德国乌尔姆大学博士后。
德意志学术交流中心(DAAD)奖学金获得者。
有20多年血液病临床及实验诊断工作及研究经验。曾先后在大连医科大学、北京大学人民医院血研所、德国乌尔姆大学、上海道培医院从事血液病临床、实验室诊断与研究。
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