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农杆菌感受态细胞的制备以及转化子的鉴定 - DNA实验基础 - 易生物

2010-10-18  bengua1985   |  转藏
   

农杆菌感受态细胞的制备以及转化子的鉴定

2010-01-13 23:30:46 来源:易生物实验 浏览次数:264 网友评论 0

一.农杆菌感受态细胞的制备
二. 双元载体转化农杆菌EHA105
三. 杆菌转化子的鉴定
A.农杆菌转化子的PCR鉴定
B.农杆菌转化子的酶切鉴定

一.农杆菌感受态细胞的制备 (同大肠杆菌质粒DNA的提取),然后将其转化大肠杆菌,再提取大肠杆菌的质粒DNA进行酶切鉴定。

取-70℃保存的EHA105于含有50μg/ml链霉素平板划线,28℃培养2天。挑单菌落接种于5ml YM(0.5g/L KH2 PO4 ,10 g/L Mannitol,2 g/L L-Glutamine,0.2 g/L NaCL,0.2 g/L MgSO4 ,0.3 g/L Yeast extract,PH7.0)液体培养基中,220rpm,28℃振荡培养18 hr 左右。将5ml菌液转接于100ml YM液体培养基中,28℃,220rpm,振荡培养至OD600 =0.5。转入无菌1.5ml的EP管,5000g离心5min,去上清液。加入1ml预冷的0.1M的CaCl2 溶液,轻轻悬浮细胞,冰上放置20min,4℃下,5000g离心5min,去上清。加入200µl预冷的含15%甘油的0.1M的CaCl2 溶液,轻轻悬浮。混匀后立即冻存于-80℃。

二. 双元载体转化农杆菌EHA105

取1µg左右的质粒DNA加入到200µl EHA105感受态细胞中,混匀后,冰浴30min;-70℃放置10min ;取出后37℃水浴5min或42℃水浴1min;冰浴2min;加入800µl YM液体培养基,28℃,175rpm摇培3hr;取出后涂在含50μg/ml Kanamycin的YM平板上,28℃培养到形成单菌落。

三. 杆菌转化子的鉴定

A.农杆菌转化子的PCR鉴定

挑取转化的农杆菌单菌落接种于含50µg/ml Kanamycin的YM液体培养基中,28℃,220rpm摇培16hr,直接用菌液做PCR。PCR反应体系如下:

反应组分 体积 终浓度 母液浓度

农杆菌转化子菌液 2µl

P1 (35S) 2µl 200nM 2µM

P2 (GUS) 2µl 200nM 2µM

10 ×PCR Buffer 2µl

Mg2+ 1.2µl 1.5mM 25mM

d NTP 1.2µl 150µM 2.5mM

Taq酶 0.2µl 1U 5U/µl

H2O 9.4µl

20µl

PCR反应参数设置如下:94℃预变性3min 后开始以下循环反应:94℃变性30秒,50℃退火1min ,72℃延伸1min,35个循环后,72℃延伸10min。反应结束后,取10µl反应液在1.0 %琼脂糖凝胶中电泳扩增产物。

B.农杆菌转化子的酶切鉴定

提取农杆菌质粒DNA(同大肠杆菌质粒DNA的提取),然后将其转化大肠杆菌,再提取大肠杆菌的质粒DNA进行酶切鉴定。

NA  

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