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结核分支杆菌Ag85B蛋白在大肠杆菌中的高效表达
吴雪琼 张俊仙 郑越 张灵霞 中国人民解放军第三0九医院结核病研究室(北京 100091) 【摘要】目的通过结核分支杆菌Ag85B基因在大肠杆菌中的表达，获得大量纯化的重组Ag85B(rAg85B)蛋白。方法应用PCR技术扩增结核分支杆菌H37RvAg85B DNA序列；以质粒pET24b为表达载体，构建Ag85B重组质粒，然后转化大肠杆菌BL21(DE3)；以IPTG诱导转化子，通过SDS-PAGE电泳鉴定rAg85B的表达水平，采用Novagen公司生产的His.Bind蛋白纯化试剂盒纯化rAg85B蛋白。结果重组质粒pET24b-Ag85B测序表明与报道的序列相同。它在大肠杆菌BL21(DE3)细胞内以包涵体形式存在，表达量占菌体总蛋白的30%左右。纯化后的rAg85B样品经SDS-PAGE和光密度扫描分析表明其纯度约为95%左右，每100 ml培养菌可获得10 mg左右纯化的重组蛋白。结论pET24b-Ag85B大肠杆菌工程菌株能高效表达rAg85B蛋白，大量纯化的rAg85B为其进一步的研究与应用奠定了基础。 【关键词】蛋白 Ag85B 基因表达 克隆 分支杆菌，结核 结核病是世界上主要的传染病之一，其致病菌结核分支杆菌分泌许多蛋白到细胞外，它们在结核患者的免疫反应中起重要作用。十几年来国内外学者一直从结核分支杆菌培养滤液中提纯蛋白质抗原进行多方面的研究，由于该方法制备蛋白抗原较烦琐、费时，因此，近年来许多研究者应用大肠杆菌来表达结核分支杆菌基因，简便地获得了大量结核分支杆菌单一的蛋白抗原。Ag85复合物是结核分支杆菌和BCG主要的分泌性蛋白，在结核分支杆菌H37Rv株中占分泌蛋白总量的30%，可从早期培养物中分离，是一种极不稳定的蛋白，经SDS-PAGE和等电聚焦分析可分为3个组分Ag85A，Ag85B和Ag85C，分别为31 kDa，30 kDa和315 kDa的蛋白质，结核分支杆菌以2∶３∶1的比例将它们三者分泌于培养液中。由于Ag85B是结核分支杆菌主要的保护性抗原，1996年Harth等［1］首次克隆、测序了结核分支杆菌Ag85B蛋白的编码基因，并表达了该蛋白。因此，本文通过结核分支杆菌Ag85B蛋白在大肠杆菌中的高效表达，大量纯化rAg85B蛋白抗原，为进一步研究其免疫学特性，研制更有效的结核病免疫诊断试剂和新型的结核病疫苗奠定了基础。 1材料与方法 11材料 111菌株和质粒来源表达载体质粒pET-24b购自Novagen公司，宿主菌大肠杆菌BL21(DE3)为北京农业大学李大伟博士惠赠；结核分支杆菌H37Rv株为本研究室保存株。 112工具酶限制性内切酶NheⅠ和HindⅢ及T4 DNA连接酶系Promega公司产品；Taq plus Ⅱ DNA聚合酶购自上海申工生物工程公司。 113试剂DNA快速纯化试剂盒购自北京华美生物工程公司；蛋白质中等分子量标准为Sigma公司产品。 114引物合成由北京奥科生物工程公司合成扩增Ag85B基因的上、下游引物。 12方法 121Ag85B基因片段的扩增在100 ?l 反应体系中，4种dNTP的终浓度为02 mmol/L，引物1，2的终浓度各为04 ?mol/L，纯化的DNA模板50 ng，Taq plus Ⅱ DNA聚合酶3 U。置DNA热循环仪扩增后，在08%琼脂糖凝胶中电泳检测992 bp的扩增片段。 122Ag85B基因片段和载体质粒DNA的酶切及回收以限制性内切酶Nhe Ⅰ和Hind Ⅲ分别对Ag85B基因片段和质粒pET-24b DNA进行双酶切。在40 ?l反应体系中，含DNA 15 ?g 左右，Nhe Ⅰ 20 U，10×反应缓冲液4 ?l，牛血清白蛋白(10 ?g/ml)04 ?l，于 37?℃ 水浴反应2 h 后，加Hind Ⅲ 20 U，于 37?℃ 水浴继续孵育2～3 h，在08%琼脂糖凝胶中电泳分析酶切结果，并用DNA快速纯化试剂盒回收。 123DNA重组、转化与鉴定参照文献［2］介绍的方法，将酶切的Ag85B基因片段和质粒pET-24b DNA片段通过T4 DNA连接酶在 14?℃ 连接过夜后，转化宿主菌大肠杆菌BL21(DE3)，筛选阳性重组子，用碱裂解法小量提取质粒进行酶切鉴定。 124DNA序列分析pET24b-Ag85B大肠杆菌工程菌中目的基因序列的测定由北京奥科生物工程公司完成。 125Ag85B基因的诱导表达将pET24b-Ag85B大肠杆菌工程菌接种于含卡那霉素50 ?g/ml的LB液体培养基中，37?℃ 培养至A600=06～08 h，诱导表达3～4 h 收集菌体。 126SDS-PAGESDS-PAGE电泳鉴定rAg85B的表达水平。将菌体悬浮于适量的1×SDS凝胶载样缓冲液中，置沸水浴中5～10 min，离心后取上清，加于45%浓缩胶和12%分离胶中进行SDS-PAGE电泳。凝胶经考马斯亮蓝G-250染色和甲醇/冰乙酸脱色后，观察结果并照相保存。 127菌体破碎和包涵体提取诱导后的pET24b-Ag85B大肠杆菌工程菌按文献［2］介绍的方法提取包涵体，取部分上清液和包涵体沉淀进行SDS-PAGE分析，以确定Ag85B在大肠杆菌中的表达形式。 128重组蛋白的回收、纯化及含量测定采用Novagen公司生产的His.Blnd蛋白纯化试剂盒纯化rAg85B蛋白，按试剂盒说明书介绍的操作步骤进行。通过Lowry法［3］测定蛋白含量，除菌过滤后置-20?℃贮存备用。 2结果 21pET24b-Ag85B重组质粒的酶切鉴定构建表达株的策略是将Ag85B编码基因插入表达载体pET24b的限制性内切酶NheⅠ和HindⅢ位点，质粒pET24b含5?310 bp，Ag85B编码基因含978 bp，而pET24b-Ag85B重组质粒中只含一个NheⅠ和HindⅢ酶切位点，因此，经这两个酶同时酶切后产生两条约5?254 bp和981 bp大小的片段。 22pET24b-Ag85B重组质粒DNA序列分析分别以T7启动子引物和T7终止子引物测pET24b-Ag85B重组子基因序列，Ag85B基因序列与基因库(EMBL数据库No.U38939)中报道的序列一致。 23pET24b-Ag85B重组质粒在大肠杆菌中的诱导表达pET24b-Ag85B重组质粒在大肠杆菌中经IPTG诱导1～4 h 后，以SDS-PAGE分析可见明显的特异表达产物带，诱导3～4 h 时表达量最多(图1)，分子量约为35 kDa左右。光密度扫描分析表明占菌体总蛋白30%左右。将诱导菌超声破碎后的上清液和沉淀部分分别进行SDS-PAGE分析，沉淀部分可见较明显的特异蛋白表达带，而上清液中只见极少量特异蛋白表达带，说明表达的rAg85B大多以细胞内不溶性包涵体的形式存在(见图2)。 24重组蛋白的纯化应用His.Bind蛋白纯化试剂盒在变性条件下纯化rAg85B蛋白，纯化后的样品经SDS-PAGE分析显示只见一条回收的蛋白带(图2)，未见其他杂带，经光密度扫描分析表明其纯度约为95%左右。经Lowry法定量后估算，每100 ml 培养菌可获得约10 mg 的重组蛋白。1，2均为IPTG诱导前； 3～6分别为IPTG诱导后1，2，3，4 h 图1SDS-PAGE鉴定重组Ag85B在大肠杆菌中的表达 1为蛋白质中等分子量标准(205，116，97，84，66，55，45，36，29，24 kDa)；2为rAg85B大肠杆菌IPTG诱导后；3，4为纯化的rAg85B蛋白；5，6分别为rAg85B表达菌超声破碎后的沉淀和上清 图2rAg85B蛋白的SDS-PAGE分析3讨论 本组构建的结核分支杆菌Ag85B大肠杆菌工程菌株，重组质粒酶切图谱与预期结果相符，其Ag85B的DNA序列也完全正确。它以包涵体形式表达，表达的融合蛋白分子量约为35 kDa。由于表达载体pET24b上携带一个6×组氨酸，它可通过形成配位键而与金属螯合亲和层析(IMAC)柱上固定化的某些二价金属离子(如镍)结合，而使重组蛋白直接纯化，获得单一融合蛋白。本文应用His.Bind蛋白纯化试剂盒纯化rAg85B蛋白，纯化程序简单，纯化效率较高，蛋白纯度可达95%左右。表达量较高，100 ml 培养菌可纯化 10 mg 左右的蛋白，纯化 1?000 ml 菌的表达蛋白就足够研究应用了。该蛋白的应用研究正在进行之中。 目前的研究表明，Ag85是一组重要的分支杆菌分泌性蛋白，具有分支菌酸转移酶活性，在分支杆菌细胞壁合成的最后阶段发挥重要的作用；Ag85蛋白或DNA疫苗免疫动物后可诱导特异的细胞和体液免疫应答；此外，活动性结核患者血清中的Ag85B水平比其他分支杆菌疾病患者和健康对照者高50～150倍［4］，而重组的Ag85B蛋白和自然分泌蛋白的免疫学特性和生物学功能无明显差别。因此，Ag85B蛋白的克隆、纯化有助于结核病的免疫学研究，促进结核病预防、治疗和诊断新制剂的发展。 |
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