发文章
发文工具
撰写
网文摘手
文档
视频
思维导图
随笔
相册
原创同步助手
其他工具
图片转文字
文件清理
AI助手
留言交流
在分子克隆实验中,限制性内切酶是必不可少的工具酶。
无论是构建克隆载体还是表达载体,要根据载体选择合适的内切酶(当然,使用T载就不必考虑了)。先将引物设计好,然后添加酶切识别序列到引物5’端。常用的内切酶比如BamHI、EcoRI、HindIII、NdeI、XhoI等可能你都已经记住了它们的识别序列,不过为了保险起见,还是得查证一下。
下面,我就总结了一些常用的内切酶的识别序列,仅供各位参考。下面这些内切酶都属于II型内切酶。
先介绍一下什么是II型内切酶吧。
The Type II restriction systems typically contain individual restriction enzymes and modification enzymes encoded by separate genes. The Type II restriction enzymes typically recognize specific DNA sequences and cleave at constant positions at or close to that sequence to produce 5-phosphates and 3-hydroxyls. Usually they require Mg 2+ ions as a cofactor, although some have more exotic requirements. The methyltransferases usually recognize the same sequence although some are more promiscuous. Three types of DNA methyltransferases have been found as part of Type II R-M systems forming either C5-methylcytosine, N4-methylcytosine or N6-methyladenine.
ApaI (类型:Type II restriction enzyme ) 识别序列: 5'GGGCC^C 3'
BamHI(类型:Type II restriction enzyme ) 识别序列: 5' G^GATCC 3'
BglII (类型:Type II restriction enzyme ) 识别序列: 5' A^GATCT 3'
EcoRI (类型:Type II restriction enzyme ) 识别序列: 5' G^AATTC 3'
HindIII (类型:Type II restriction enzyme ) 识别序列: 5' A^AGCTT 3'
KpnI (类型:Type II restriction enzyme ) 识别序列: 5' GGTAC^C 3'
NcoI (类型:Type II restriction enzyme ) 识别序列: 5' C^CATGG 3'
NdeI (类型:Type II restriction enzyme ) 识别序列: 5' CA^TATG 3'
NheI (类型:Type II restriction enzyme ) 识别序列: 5' G^CTAGC 3'
NotI (类型:Type II restriction enzyme ) 识别序列: 5' GC^GGCCGC 3'
SacI (类型:Type II restriction enzyme ) 识别序列: 5' GAGCT^C 3'
SalI (类型:Type II restriction enzyme ) 识别序列: 5' G^TCGAC 3'
SphI (类型:Type II restriction enzyme ) 识别序列: 5' GCATG^C 3'
XbaI (类型:Type II restriction enzyme ) 识别序列: 5' T^CTAGA 3'
XhoI (类型:Type II restriction enzyme ) 识别序列: 5' C^TCGAG 3'
当然,上面总结的这些肯定不全,要查找更多内切酶的识别序列,你还可以选择下面几种方法:
1. 查你所使用的内切酶的公司的目录或者网站;NEB网站上提供的识别序列图表 下载
2. 用软件如:Primer Premier5.0或Bioedit等,这些软件均提供了内切酶识别序列的信息;
3. 推荐到NEB的REBASE数据库去查(网址:http://rebase./rebase/rebase.html)
当你设计好引物,添加上了内切酶识别序列,下一步或许是添加保护碱基了,可以参考:http://www./html/86.html
NEB公司网站提供的保护碱基参考表下载 http://blog./user1/2081/archives/2009/230768.shtml
NEB公司网站上关于设计PCR引物保护碱基的参考 http://www./userfiles/file/protect.doc
双酶切buffer的选择 MBIhttp://www./doubledigest/index.html
罗氏http://www./benchmate/refinder.htm
NEBhttp://www./nebecomm/DoubleDigestCalculator.asp
Promega http://www./guides/re_guide/research.asp?search=bufferTakara http://catalog./en/product/basic_info.asp?unitid=U100005593
这里再给大家推荐一种新的不需要连接反应的分子克隆方法,优点包括:
①设计引物不必考虑选择什么酶切位点;
②不必考虑保护碱基的问题;
③不必每次都选择合适的酶来酶切质粒制备载体;
④而且不需要DNA连接酶;
⑤假阳性几率低(因为没有连接反应这一步,载体自连的问题没有了)。
另外,还有一个经济问题:如果一次性制备一批载体(小提一次质粒约80μL),并将之线性化(可双酶切亦可单酶切),然后每次做分子克隆实验时用一点,大约可以做约40次转化,管上一年没问题,呵呵。
来自: SonGohan > 《DNA重组技术》
0条评论
发表
请遵守用户 评论公约
打破传统酶切克隆的新方法:基于IIS型限制性内切酶克隆
打破传统酶切克隆的新方法:基于IIS型限制性内切酶克隆1什么是IIS型限制性内切酶?我们最常使用的限制性内切酶(如EcoRI)属于Type II,...
【生工技术】使用SnapGene进行DNA序列分析
【生工技术】使用SnapGene进行DNA序列分析。在氨基酸序列上右击,可以将CDS的氨基酸序列进行三字母和单字母替换,也可以将CDS的氨基酸序...
玩转质粒系列二:过表达基因序列获取与重组质粒构建
玩转质粒系列二:过表达基因序列获取与重组质粒构建。首先,根据目的基因CDS序列的长短,可以通过两种方法获取目的基因序列:(1)设计C...
核酸的提纯与限制性内切酶
核酸的提纯与限制性内切酶。核酸研究中还有一个常用的工具,叫做限制性核酸内切酶(restriction endonucleases,REases)。它是内切酶的...
限制酶可以来自真核生物吗
限制酶可以来自真核生物吗限 制 性 内 切 酶 综 述(Restriction Endonucleases: An Overview) 30多年前,当人们在对噬菌体的宿主特异性的限制-修饰现象进行研究时,首次发现了限制性内切酶。当限制性内...
引物假酶切位点
酶切位点前加保护碱基 1,两个酶切点至少隔上3个碱基,在做载体构建的时候设计引物扩增片段进行定向连接,除了酶切位点,还要在两端加一个三个核苷酸的保护序列,否则PCR产物很难被酶切,因此就会导致...
质粒构建详尽版(一)
如:EcoRI来源于大肠杆菌E.coli的RY13菌株,I指在该菌株中分离的第一个限制酶活单位定义:在适当的条件下(T,pH,离子强度等)一小时内...
生物学案系列21----6.2 基因工程及其应用
2.基因的"针线"——DNA连接酶:缝合脱氧核糖和磷酸交替连接而构成的DNA骨架上的缺口。这是应用了酶的( ) A.高效性 B.专一性 C.多样性 D.催化活性受外界条件影响 6. 在基因工程...
诺贝尔生理学或医学奖名人堂:史密斯
20世纪60年代,沃纳·阿尔伯(Werner Arber)首次从理论上提出了DNA限制性内切酶的存在,认为人类可以运用DNA限制性内切酶对重要的...
微信扫码,在手机上查看选中内容