银屑1号治疗寻常性银屑病作用机理

银屑1号治疗寻常性银屑病作用机理

寻常性银屑病是一种常见的红斑、鳞屑性皮肤病，目前尚无完全治愈的方法，临床治疗主要以控制症状，延长缓解期，减少复发为主。中医中药在治疗银屑病方面有其独到疗效，“血热”被认为是其病理基础。为了寻找更好的银屑病治疗方法，我院皮肤科拟定银屑I号方剂，经过l0余年临床运用，取得满意疗效。为进一步探讨银屑l号治疗银屑病的作用机理，采用ELISA方法检测银屑l号治疗前后患者血清单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)、肿瘤坏死因子a(TNF-a)、白介素8(IL-8)表达的变化；用MqT法检测大鼠银屑I号含药血清对HaCaT细胞增殖的影响，现将研究结果总结如下。

1.临床研究

1.1临床资料

2005.01—2007.10本院门诊皮肤科患者共15例，男11例，女4例，年龄l2～68岁；病程l～l0年。诊断标准参照文献。病例选择标准：①临床为寻常性银屑病，进行期或静止期，②中医辨证为血热证，症见皮肤红斑、鳞屑，颜色鲜红，鳞屑较多，伴心烦，口渴，咽痛，大便秘结，小便短赤，舌质红，苔薄黄或黄腻，脉弦滑或滑数。③此次治疗前未进行光化学治疗，4周内未系统用糖皮质激素、免疫抑制剂、维甲酸或中药治疗。④无心、脑、肾、肝胆疾患。

1.2方法

1.2.1治疗给药银屑l号：由生地209、丹皮159、生石膏209、白茅根309、白花蛇舌草209、紫草209、知母109、银花159组成，为我院制剂室复方中药煎剂(含生药1.0g/nl)，每次150ml，每日2次口服，1个月为1疗程，共用2个疗程。

1.2.2观察指标及测定

1.2.2.1标本采集无菌采集的15例银屑病患者治疗前后静脉血各3ml，离心后收集血清，分装标记后置于一20℃冰箱保存待测。

1.2.2.2血清MCP一1、IL一8、TNF—a的检测取出所需反应板，加入10皿标准品(StanmdaIds)、10m血清于相应反应板孔中，每孔内加入50tAnti ratIL-8 POD和50thAnti rat IL-8Biotin，轻轻摇匀30秒，封住板孔，室温温育45分钟。洗板：甩尽板内液体，用洗涤液洗涤反应板(每孔内加入350rd洗涤液)，并去除水滴(在厚叠吸水纸上拍干)；反复洗涤5次。每孔加入1ooa显色液，轻轻混匀10秒。室温温育20分每孔加入100ul终止液(Stop Solution)，轻轻混匀30秒；30分钟内在450nm处读OD值。以OD值为纵坐标，以标准品浓度为横坐标，绘制标准曲线，根据血清样品的OD值可在标准曲线上查出其浓度。MCP-1、TNF—a检测方法与IL-8类似(试剂盒购自美国Bl0—PAD公司)。

1.2.3统计学分析采用SPssl0.0软件进行分析。治疗前后清细胞因子变化采用t检验分析。

1.3结果见表1。

表1    治疗前后银屑病患者血清

MCP一1、TNF—a、    IL一8的变化(x±s)

组别 n  MCP-1(pg/ml)    TNF-a(pg/ml) JL一8(pg/ml)

治疗前    15 235.65±l6.83 386.98±25.325   62.75±45.38

治疗后    l5 105.62±15.32 98.62±12.05    212.68±22.35

与治疗前比较*P<0.05，**P<0.01

2.实验研究

2.1实验材料

2.1.1动物健康SD大鼠l2只，雌雄各半，体重(250±10)9，由浙江中医药大学动物实验室提供。

2.1.2药品及主要试剂银屑I号：见1.2.1。HaCaT细胞株：美国Providence大学万寅生先生惠赠。RPMl640培养基：美国，Gibc0公司。胎牛血清：杭州四季青生物材料有限公司。MI-I'：美国，Sigma公司。

2.1.3仪器超净工作台：苏州净化设备仪器厂。Ⅸ一70型倒置显微镜：日本OLYMPUS公司。HFl51UV c02培养箱：上海力新实业有限公司。BAS02002—2型离心机：台湾贝索企业公司。Wellscan MK3型酶标仪：芬兰Labsystems公司。DNP-9052型电热恒温培养箱：上海精宏实验设备有限公司。SW-80A旋涡混合器：上海医科大学仪器厂。

2.2实验方法

2.2.1含药血清的制备将SD大鼠分为2组：实验组和对照组，每组6只，实验组每天予以银屑1号方灌胃，每次30#kg(7.5m1)，每日2次；对照组，每日予以等量生理盐水灌胃，方法同上。灌胃9天后，30％戊巴比妥麻醉大鼠，无菌条件下进行腹主动脉取血3ml。静置10分钟后，l000r／rain离心10分钟，超净台用无菌注射器抽取血清lml，一20。(2冰箱保存备用。

2.2.2细胞培养H_aCaT细胞培养在RPMl640培养基中，以1×10'／ml的浓度接种到96孔培养板中，常规孵育，待细胞生长至80％融合时，分别加入含实验组含药血清的培养基200ul，含药血清的终浓度分别为5％和l0％。对照组血清终浓度也分别为5％和l0％。每份血清设2个复孔。

2.2.3细胞增殖的MTr测定HaCaT细胞用含药血清处理48小时后，每孔分别加入MTr20ta，继续孵育4小时后，弃上清液，每孔加入二甲基亚砜200ta，振荡10分钟后，置酶标仪上570nm波长测定吸光度A值，进行分析。

2.2.4统计学方法

数据用SPSSl0.0软件进行单因素方差分析(ANOVA)，并用S—N—K法对数据进行两两比较。

2.3实验结果见表2。

表2  银屑l号含药血清对HaCaT细胞增殖的影响

组别 A值

5％空白血清组0.260±0.036

5％含药血清组0.145±O.023

10％空白血清组0.256±0.028

10％含药血清组0.106±O.032

与空白血清组比较*P<0.05，**P<0.01

3.讨论

银屑l号为我院治疗银屑病的经验方，经过多年的临床运用，治疗血热型银屑病的疗效确切。我们经前期临床观察，与窄波UVB治疗对照比较，疗效相当。方中生地味甘苦性寒，清热凉血；丹皮凉血活血；白茅根、紫草凉血养阴；生石膏清热凉血、生津通便；白花蛇舌草清热解毒。综观全方，具有凉血、解毒、活血之功。

近年来研究表明，郎格汉斯细胞在银屑病的发病机制中发挥重要的启动、触发作用。已证实MCP一1是趋化郎格汉斯细胞的主要趋化因子之一，对外周T淋巴细胞也有明显的趋化作用。外周血中MCP一1的高表达可能导致银屑病皮肤中郎格汉斯细胞异常的生物学功能，从而启动一系列异常免疫反应，导致银屑病的发生[5]。TNF-a、IL-8在银屑病发病机制中的关键作用也已经有研究证实。Mizutani报道，银屑病患者血清中TNF-a水平高于正常人，Sticherlin9等证实银屑病皮损中IL-8高于正常l00倍，血浆中IL一8水平中度增高。本文对应用银屑I号治疗的l5例患者进行了治疗前后MCP-1、TNF-a、IL-8定量检测，结果显示：各指标治疗后较治疗前均明显下降，由此提示，MCP一1、TNF—a、IL一8参与了银屑病的发病过程，银屑l号治疗机理可能与下调MCP一1、TNF—a、IL一8的表达有关。

银屑病主要病理表现为表皮过度增殖伴真皮炎症反应。角质形成细胞是人体表皮中的主要细胞成分，占表皮细胞的80％以上，它可以分泌多种细胞因子，IL一1、IL一6、IL一8、IL—l0、THF-a等，参与免疫调节。HacaT细胞是一种源于人正常皮肤角质形成细胞的永生化细胞系，其主要生物学特性均与正常角质形成细胞类似，与原代Kc相同，具有表皮基底层细胞的分化特性。目前已被用于包括银屑病在内的多种皮肤病的体外研究。Finch等学者也都采用HaCat细胞株研究银屑病的病理生理改变。本实验采用HaCaT细胞体外培养，模拟银屑病Kc增殖，以HaCaT细胞为靶细胞，以银屑I号含药血清为研究的目标物，研究其对HaCaT细胞生长增殖的影响。

选择用MIT法检测大鼠银屑I号含药血清对HaCaT细胞增殖的影响，结果证实银屑I号含药血清对HacaT细胞增殖有显著抑制作用。5％及l0％的含药血清组细胞增殖均受到显著抑制，其中10％含药血清组细胞增殖的抑制最明显。由此证明，银屑I号治疗银屑病的作用与下调MCP-1、TNF-a、IL-8的表达有关，动物实验证明其对HaCaT细胞的增殖具有显著的抑制作用。