微小RNA与脑缺血后神经元凋亡

随着生活水平的提高，卒中发病率呈现逐年增高的趋势。根据心血管疾病发病趋势与决定因素监测（Monitoring Trends and Determinants in Cardiovascular Disease，MONICA）研究的结果，在中国，卒中发病率正以每年近 9% 的速度上升，目前已成为中国位居第一的致死病因。缺血性卒中约占所有卒中的 60%-80%。

miRNA 是一类高度保守的非编码小 RNA 分子，主要通过与靶基因 mRNA 结合，促进其降解或抑制其翻译而发挥负性调节作用。脑组织中存在着一些特有的 miRNA，它们参与了神经系统不同生理病理学过程的调控，如神经系统发生、发育、突触形成和神经保护。凋亡是细胞在生理和病理条件下发生的一种主动死亡方式，是受细胞内基因和细胞外因子调控的级联反应过程。神经元凋亡是脑缺血病理生理学过程的必经阶段。随着对 miRNA 和脑缺血病理生理学机制研究的不断深入，miRNA 在脑缺血时神经元凋亡中的作用日益受到重视。

1 miRNA

miRNA 是一类高度保守的非编码 RNA 分子，长度约为 18-22 个碱基对。它首先通过 RNA 聚合酶Ⅱ产生原始 miRNA，然后经过 RNA 聚合酶Ⅲ核酸内切酶的裂解，产生 miRNA 前体。后者在输出蛋白 5 的作用下由细胞核进入细胞质，最后在双链 RNA 转移性内切酶 Dicer 的作用下形成成熟的单链 miRNA。单链 miRNA 与 RNA 诱导的沉默复合物（miRNA induced silencing complex， miRISC）相结合，进而识别 mRNA 上与 miRNA 序列互补的 3'- 非翻译区（3'-untranslated region，3'-UTR），通过裂解靶基因的 mRNA 导致其转录后沉默。尽管迄今只发现了数百种 miRNA，但每种 miRNA 都可能调节数百个靶基因，人类超过 1B 的基因可能由 miRNA 调控。miRNA 在许多生理和病理学过程中都起着重要作用，如肿瘤形成、增生、血细胞生成、新陈代谢、免疫功能、实验胚胎学及神经变性性疾病等。miRNA 在神经系统中大量表达，脑组织中特有的 miRNA 包括 miR-9、miR-124a、miR-124b、m1R-135、miR-153、miR-183 和 miR-219。对卒中患者进行的 miRNA 表达谱研究显示，miRNA 是诊断和预测缺血性卒中的一类有效的生物学标记物。研究还显示，众多 miRNA 参与了缺血性卒中的病理生理学过程。

图 1 脑缺血时神经元凋亡的病理生理学过程

AMPA：α- 氨基羟甲基恶唑丙酸：NMDA：N- 甲基 -D- 天冬氨酸；ROS：活性氧

2  脑缺血和神经元凋亡

脑缺血时，脑血管闭塞，氧和葡萄糖供给减少，神经细胞膜 Na⁺/K⁺ 泵衰竭，细胞膜去极化，引起谷氨酸盐等兴奋性神经递质释放，谷氨酸盐与相应受体结合，引起 Ca²⁺ 内流和 NO 合酶激活增加，线粒体功能发生障碍，最终引起细胞凋亡（图 1）。该过程包括兴奋性氨基酸毒性作用、氧化应激、炎症反应、水肿等过程，最终导致神经元发生不可逆性损伤。

凋亡是一种程序性细胞死亡，主要由内源性和外源性 2 种途径来完成。内源性途径由内源性信号，如 DNA 损伤或氧、葡萄糖减少，介导和导致线粒体功能障碍。例如，由活性氧（reactive oxygenspecies，ROS）介导的 DNA 氧化损伤可激活 p53，然后启动细胞促凋亡基因 -Bak1、Bad 和 Bax 转录，这些基因编码的蛋白与 BH3 结构域死亡受体激动剂相互作用，在线粒体膜上形成针孔，使相关的促凋亡蛋白——凋亡诱导因子、细胞色素 c 等外漏。细胞色素 c、胱冬酶 -9 前体和凋亡肽酶激活因子（Apaf-1）形成凋亡小体，通过蛋白裂解使胱冬酶 -3 前体转化为胱冬酶 -3。外源性途径由外源性信号活化，这些外源性信号以配体 - 受体相互作用的形式存在。例如，肿瘤坏死因子 -α（tumor necrosisfactor-α，TNF-α）和 Fas 配体分别与 TNF-α受体和 Fas 受体（Fas receptor，FasR）结合，继而启动死亡诱导信号复合物的形成，后者将胱冬酶一 3 前体裂解为胱冬酶 -3。胱冬酶 -3 是细胞凋亡的关键介质，通过裂解重要的细胞功能蛋白引起细胞死亡。

3 微小 RNA 与神经元凋亡

神经元凋亡主要见于缺血半暗带。阻止凋亡的发展有可能减轻脑缺血时脑损伤程度并缩小梗死范围。由于梗死后脑损伤的快速进展，卒中导致神经元死亡和神经功能缺损的确切机制尚不完全清楚。许多研究显示，一些 miRNA 在脑缺血后神经元凋亡的病理生理学机制中起着重要作用（表 1）。

3.1 抗凋亡 miRNA

3.1.1 miR-21

miR-21 是生物体内的重要抗凋亡因子。TNF-α家族成员 Fas 配体基因（Faslg）为 miR-21 的靶点。众所周知，TNF-α信号参与了缺血性神经元损伤。对 Faslg 基因突变小鼠（不能与 FasR 结合）神经元进行体外培养的研究显示，神经元对氧一葡萄糖剥夺（oxygen-glucose deprivation，OGD）引起的细胞凋亡具有抵抗作用。miR-21 通过与对应的受体（FasR）结合诱导细胞死亡。Buller 等的研究显示，缺血半暗带神经元 miR-21 表达上调。当 miR-21 在体外过度表达时，其通过靶作用于 Faslg，使神经元对凋亡的敏感性降低，阻碍了由 OGD 诱导的细胞凋亡。因此，miR-21 对减少缺血半暗带神经元死亡起着关键作用。

3.1.2 miR-125b

m1R-125b 在脑组织中含量丰富，其靶点为 p53。当 miR-125b 表达下调时，p53 表达也上调，miR-125b 介导的 p53 表达下调严格取决于 miR-125b 与 p53 mRNA 的 3'-UTR 结合位点。miR-125b 过度表达会抑制内源性 p53 蛋白水平，同时也会抑制凋亡；相反，敲除 miR-125b 基因可上调 p53 蛋白表达水平并诱导凋亡。在该过程中，miR-125b 被认为是内源性凋亡途径的调节器。大鼠大脑中动脉闭塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）后，miR-125b 在再灌注 3h 内表达下调。这可能是卒中急性阶段早期神经元凋亡的机制。

3.1.3 Let-7a

表 1 参与脑缺血神经元凋亡的 miRNA

^a miR-17-92 簇包括 miR-17-5p、miR-17-3p、miR-18a、miR-19a、miR-20a、miR-19b-1 和 miR-92a

Let-7 家族包括 11 个紧密相关的基因，在脊椎动物和非脊椎动物中均高度保守，其在分化后表达上调，主要存在于成熟组织，胚胎阶段很少能检测到。Let-7a 是 Let 一 7 家族成员之一。有研究表明，let-7a 5' 末端起始的 8 个核苷酸与胱冬酶 -3 3'-UTR 端的第 153～159 位核苷酸完全配对。Let-7a 的靶基因为胱冬酶 -3，通过下调胱冬酶 -3 表达抑制凋亡。在人和大鼠脑缺血后的 miRNA 表达谱中，let-7a 表达均下调。研究显示，Let-7a 在脑缺血后 0～48h 内表达，与神经细胞死亡贯穿卒中急性阶段和恢复阶段一致。

3.1.4 miR-17-92 簇

在缺血缺氧条件下，miR-17-92 簇通过与 p53 特异性结合，介导转录抑制。缺氧时，p53 不断蓄积，使 miR-17-92 簇表达下调，导致神经细胞快速死亡。一系列研究显示，凋亡前体基因 BCL2L11/BIM 是 miR-17-92 簇中许多成员的直接靶点。Bim 是一个凋亡前蛋白，在多种细胞中通过与 Bcl-2 等抗凋亡蛋白对抗调节细胞死亡。在小鼠模型中，miR-17-92 簇通过下调 Bim 表达加速疾病进展。c-Myc 癌基因产物能促进细胞生长、增殖和凋亡。Xiao 等的研究显示，miR-17-92 簇能通过靶作用于 Bim，减少 c-Myc 诱导的凋亡。

3.2 促凋亡 miRNA

3.2.1 miR-29 和 miR-29b

miR-29 通过沉默 p85α（磷酸肌醇激酶 3 调节亚基）和 CDC42 诱导 p53 表达。p85α通过激活 Akt 介导的 MDM2 E3 连接酶使 p53 泛素化，从而降解 p53。不过，CDC42 与 p53 之间的作用机制目前尚不完全清楚。在卒中患者的 miRNA 表达谱中，miR-29 表达上调，p53 表达上调，从而促进神经元凋亡。有研究显示，大鼠 MCAO 和 OGD 后，miR-29b 表达水平显著上调。miR-29b 靶作用于 Bcl2L2，后者为 Bcl-2 家族成员之一，是细胞凋亡的重要决定簇，其表达下调可引起细胞异常死亡。该研究还显示，经 miR-29b 处理的神经元会过度表达 Bcl2L2，神经元死亡率显著降低。因此，miR-29b 在缺血性脑损伤时通过抑制 Bcl2L2 表达促进神经细胞死亡。

3.2.2 miR-34a

miR-34a 是 p53 的作用靶点。Welch 等的研究显示，miR-34a 通过激活胱冬酶介导的凋亡通路诱导凋亡。He 等的研究显示，miR-34a 能直接作用于 bcl-2，促进细胞凋亡。Chen 等的研究显示，经 miR-34a 处理的细胞 YY1 蛋白水平显著下降，细胞凋亡增加。YY1 是一种常见的转录因子，是 p53 的负性调控蛋白。因此，YY1 是 m1R-34a 的另一个重要直接作用靶点，其密切调节 p53 的活性。

3.2.3 miR-338-3p

miR-338-3p 主要存在于神经元的远端轴突中，凋亡相关酪氨酸激酶（apoptosis associated tyrosinekinase，AATK）为其靶点。AATK 和 miR-338 均为高度保守基因，在脊椎动物中枢神经系统中显著表达。AATK 表达水平增高可促进神经突触生长，而上调 AATK 表达可促进体外培养的小脑颗粒神经元凋亡，说明一定量的 AATK 对于神经元生长和维持动态平衡非常重要。miR-338-3p 主要通过抑制 AATK 表达调控神经缅胞凋亡。

3.2.4 miR-497

Yin 等的研究显示，MCAO 小鼠脑组织中，miR497 表达呈上调趋势。该实验证实，miR-497 表达上调可加剧 OGD 诱导的神经元脱失。miR-497 直接与 bcl-2/-w 基因上的 3'-UTR 靶位点结合，抑制抗凋亡蛋白 BCL-2/-w 表达，从而促进神经元缺血性死亡。该实验还显示，敲除 miR-497 基因能有效增高小鼠局灶性脑缺血后缺血部位 BCL-2/-w 蛋白水平，从而缩小脑梗死体积并改善神经功能。

3.2.5 miR-200c

在脑缺血模型大鼠 miRNA 表达谱中，miR-200c 表达显著上调。miR-200c 主要参与缺血性脑损伤过程中的神经元凋亡，其诱导凋亡的靶作用基因有 2 个：Fas 相关蛋白酪氨酸磷酸酶 1（Fas-associatedprotein-tyrosine phosphatase 1，FAP-1）和 ZEB1 。miR-200c 作用于 FAP-1，使细胞对 Fas 介导的凋亡更敏感，从而促进神经元凋亡。此外，脑缺血时皮质神经元中 ZEB1 表达下调也可诱导细胞凋亡。缺血损伤后脑组织产生的氧自由基诱导 miR-200c 表达上调，后者通过抑制 ZEB1 表达促进细胞凋亡。

3.2.6 miR-181

脑组织中 miR-181 含量丰富。Ouyang 等的研究显示，miR-181 可促进缺血性脑损伤。该研究将缺血半球分为坏死中心和半暗带，再灌注早期 miR-181 在细胞注定死亡的区域表达上调，但在潜在可挽救区域表达下调。miR-181 的靶基因为 GRP78，后者过度表达可减轻缺血损伤和氧化应激，并维持线粒体功能。因此，敲除内源性 miR-181 基因能保护脑细胞免受缺血诱导的细胞凋亡。

4 问题与展望

减少神经细胞凋亡对于减轻缺血性脑损伤至关重要。目前，仅可通过在缺血性卒中发病 4.5 h 内使用组织型纤溶酶原激活剂（tissue plasminogen activator，tPA）进行溶栓治疗，再通闭塞血管，从而恢复半暗带供血，挽救濒临凋亡的神经元。然而，由于治疗时间窗以及适应证的限制，我国仅有不到 2% 的缺血性卒中患者能接受 tPA 治疗。因此，发现减少卒中后缺血半暗带神经元凋亡的新药具有重要的价值。随着对 miRNA 在缺血性卒中神经元凋亡中作用机制的逐渐理解，将为脑保护的理解提供新的视角，从而促进卒中治疗中神经保护药物的开发。虽然有关 miRNA 作为治疗靶点的研究很多，但在将其正式应用于临床之前，仍有许多问题亟待解决。首先是给药方式的选择，静脉用药、口服用药还是其他方式更合适。体内研究表明，antaomir 在治疗中枢神经系统疾病时应选择脑室注射用药，且确实有效。其次，miRNA 制剂进人体内后能否准确作用于其靶点。尽管只发现了数百种 miRNA，但每种 miRNA 都可能调节数百个靶基因，miRNA 进人体内后很有可能与多种靶基因结合并产生多种作用。再次，miRNA 制剂在体内的稳定性目前还不清楚，是否会被体内一些物质降解或修饰等。这些均需要深入研究每种 miRNA 的作用靶点、发挥的功能及其在整个病理生理学过程中的作用机制，从而为 miRNA 治疗缺血性卒中提供可靠的依据。

综上所述，确定这些特定的 miRNA 在缺血后神经元凋亡中的关键作用，不仅扩大了对 miRNA 功能的理解，同时也为减轻缺血性脑损伤的治疗策略提供了新的方向。

编辑： 雨声