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摘要： 二维电泳即双向电泳,是蛋白质分析常用的技术手段.本文总结了二维电泳中常见的14个问题并对其解答.
二维电泳即双向电泳,是蛋白质分析常用的技术手段.第一向等电聚焦电泳：根据蛋白的等电点分离蛋白质;第二向SDS-PAGE电泳：根据蛋白分子量的大小分离蛋白质.本文总结了二维电泳中常见的14个问题及其解答. 1. 重泡胀后的胶可以不用转移到另一个电泳槽,直接跑2D的一向吗? 一般情况下是可以的.但当上样量特别大时,可能会有一部分蛋白质没有被胶条吸收,这样跑完1D和2D胶后,会有很多横向条纹.所以在这种情况下,最好在重泡胀后,将胶条转移到另外一个电泳漕中进行电泳. 2. 为什么我在等电聚焦前加的矿物油在聚焦后会减少,暴露出了胶条的背面? 这是因为BioRad的电泳槽有个盖子.为了固定电泳槽中的胶条,这个盖子上设计了对应的突起,以便压住胶条.由于虹吸作用,这个突起会导引矿物油到相邻的空电泳槽,从而降低有胶条的电泳槽中的矿物油液面.如果由此把胶条暴露在空气中,那对等电聚焦的影响将是毁灭性的.为了防止这个现象的发生,可以在相邻的空电泳槽里,也加入适量(80%满)的矿物油. 3. 跑第一向时,为什么要设定一个电流的最大值电压(50μA/胶)? 电流的平方和功率成正比.电流增大,功率增大,放出的热量也随之增大,就会导致胶条的温度增加.当温度超过30摄氏度时,缓冲液里的尿素就容易解离,产生一些极性分子,从而对等电聚焦产生影响. 4. 跑第一向时,为什么刚开始的电压比较低,而后逐渐增高? 刚开始时,体系内的带电小分子比较多(比如无机盐和双极性分子).所以在这个阶段,电流主要是由这些小分子的移动所产生的.由于这些分子质量小,移动他们不需要很高的电压.当这些小分子移动到他们的目的地时(无机盐移动到极性相反的电极;两性分子移动到对应的pH条带),体系内的蛋白质才开始肩负起运载电流的任务,逐渐向所对应的pH区域移动. 5. 跑第一向时,为什么会产生一条蓝色的条带,并逐渐向酸性端移动? 蓝色条带是缓冲液中痕量的溴酚蓝被聚焦所产生的.溴酚蓝也是pH指示剂,当它移动到酸性区时(pH4 ),颜色会变成黄色.溴酚蓝的这个移动过程大体上发生在极性小分子的聚焦之后,蛋白质大分子聚焦之前. 6. 跑第一向时,为什么电压总达不到预定值? 当上样量比较大时或体系内盐分比较多时,聚焦的电压有可能达不到所设定的数值. 7. 跑第一向时,在电压达到预定值后,电流为什么会降低? 当上样量比较少时,所有蛋白在较短的时间内就移动到所对应的pH值区域值,从而变成中性分子.这样,体系的电阻越来越大,在恒定的电压下,电流就会越来越小. 8. 跑第一向时,为什么在两个电极丝附近有气泡产生? 等电聚焦完成后,所有的蛋白质都移动到了相应的pI值区域,而成为中心分子.这是加在体系上的电压就开始电解水分子,在阳极产生氧气,在阴极产生氢气. 9. 重泡胀缓冲液(rehydration buffer)中的硫脲的作用是什么,双极性分子的作用是什么? 硫脲的作用是增加蛋白质的溶解性,特别是碱性蛋白的溶解性.双极性分子的作用也是增加蛋白质的溶解性.当蛋白移动到相应的pH值后,就变成了中性分子.而不带电荷的蛋白质分子容易聚集,从而降低其在随后的二向胶时的迁移效率,可能会造成竖的脱尾.而硫脲和双极性小分子则会鉴定中性蛋白质之间的相互作用,防止它们的聚集. 10. 怎样估计2D胶上蛋白质点的分子量和pI值? 可以用 BioRad生产的2D胶标准蛋白来校准.也可以用体系内已知蛋白来做比对. 11. 为什么2D胶上的蛋白点有横的和竖的脱尾? 横的脱尾可能是：1)一向等电聚焦不完全; 2)某些蛋白质本身的原因(糖蛋白); 3)蛋白的丰度太高.竖的脱尾是因为跑二向时,蛋白的溶解度不好. 12. 什么成分会影响2D胶的效果? 核酸,盐,去垢剂等等. 13. 2D胶的上样量应该在什么范围? 上样量和样品有关.样品内蛋白种类多的上样量要大些,这样每个点才有足够的量被检测到.一般的全细胞裂解体系,上样量大概在100微克(银染)到500微克(考染)之间. 14. 我的蛋白质浓度很低,应该用什么方法来浓缩? 蛋白质的浓缩有很多方法.大致有超滤法,沉淀法和透析法.超滤比较温和,对蛋白质不会有修饰和改变,蛋白的种类一般不会有丢失.它的缺点是总样品的量可能会减少(被膜所吸附).另外超滤对样品的要求比较高.甘油,去垢剂都会堵塞滤膜,影响超滤的效果.沉淀法比较快速,容易操作,对盐,甘油,去垢剂的耐受性好.缺点是可能会有部分种类的蛋白没有被沉淀下来(丢失).沉淀法中,又以TCA法最为普遍使用.使用TCA法时,一定要用冷的纯丙酮清洗蛋白沉淀两次,去处残留的TCA和其他沉淀下来的杂质.透析法只使用于量比较大的样品,量小时,操作困难. 透析法可以和超滤法联用.先把样品透析到一个比较干净的环境(不含盐,甘油,去垢剂或其它杂质,比如碳酸氢氨溶液),然后再进行超滤. 注意事项： 要想获得比较好的电泳结果,蛋白样品的制备是很关键的一个步骤,蛋白样品中存在杂质会影响等点聚焦,一定要采取有针对性的办法去除相应的杂质例如：盐和带电小分子、核酸等. |
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