自噬是近年来很热门的领域,很多人傻傻分不清自噬和死亡。今天就带大家一起来复习一下。 步骤 2: Phagophore 不断延伸,将胞浆中的任何成分,包括细胞器,全部揽入「碗」中,然后「收口」,成为密闭的球状的「自噬体」,即 autophagosome。电镜下观察到自噬体是自噬发生的铁证之二。有 2 个特征:一是双层膜,二是内含胞浆成分,如线粒体、内质网碎片等。 步骤 3:自噬体形成后,可与细胞内吞的吞噬泡、吞饮泡和内体融合(加了个「可」字,意思是这种情况不是必然要发生的)。 步骤 4:自噬体与溶酶体融合形成 autolysosome,期间自噬体的内膜被溶酶体酶降解,二者的内容物合为一体,自噬体中的「货物」也被降解,产物(氨基酸、脂肪酸等)被输送到胞浆中,供细胞重新利用,而残渣或被排出细胞外或滞留在胞浆中。 正常培养的细胞自噬活性很低,不适于观察,因此,必须对自噬进行人工干预和调节,经报道的工具药有: 1. 自噬诱导剂
2. 自噬抑制剂
除了选用上述工具药外,一般还需结合遗传学技术对自噬相关基因进行干预:包括反义 RNA 干扰技术(Knockdown)、突变株筛选、外源基因导入等。 细胞经诱导或抑制后,需对自噬过程进行观察和检测,常用的策略和技术有: 1. 观察自噬体的形成 由于自噬体属于亚细胞结构,普通光镜下看不到,因此,直接观察自噬体需在透射电镜下。Phagophore 的特征为:新月状或杯状,双层或多层膜,有包绕胞浆成分的趋势。 自噬体(AV1)的特征为:双层或多层膜的液泡状结构,内含胞浆成分,如线粒体、内质网、核糖体等。 自噬溶酶体(AV2)的特征为:单层膜,胞浆成分已降解。(autophagic vacuole,AV) 2. 在荧光显微镜下采用 GFP-LC3 融合蛋白来示踪自噬形成 由于电镜耗时长,不利于监测(Monitoring)自噬形成,人们利用 LC3 在自噬形成过程中发生聚集的现象开发出了此技术。无自噬时,GFP-LC3 融合蛋白弥散在胞浆中;自噬形成时,GFP-LC3 融合蛋白转位至自噬体膜,在荧光显微镜下形成多个明亮的绿色荧光斑点,一个斑点相当于一个自噬体,可以通过计数来评价自噬活性的高低。 3. 利用 Western Blot 检测 LC3-II/I 比值的变化以评价自噬形成 自噬形成时,胞浆型 LC3(即 LC3-I)会酶解掉一小段多肽,转变为(自噬体)膜型(即 LC3-II),因此,LC3-II/I 比值的大小可估计自噬水平的高低。 LC3 抗体对 LC3-II 有更高的亲和力,会造成假阳性。方法 2 和 3 需结合使用,同时需考虑溶酶体活性的影响。 4. MDC 染色 MDC 染色即 Monodansylcadaverine,单丹磺酰尸胺染色,包括自噬体,所有酸性液泡都被染色,故属于非特异性的。 5. CellTrackerTM Green 染色 主要用于双染色,但其能染所有的液泡,故也属于非特异性的。 在研究自噬相关蛋白时,需对其进行定位。由于自噬体与溶酶体、线粒体、内质网、高尔基体关系密切,为了区别,常用到一些示踪蛋白在荧光显微镜下来共定位:
Note:这些蛋白均为胞浆蛋白,爬片或胰酶消化的细胞在做免疫荧光前需先透膜(permeablize),可采用 0.1% SDS 处理。 参考文献:
本文经作者系 @丁香园中级站友 biofish,点击「阅读原文」查看淋巴细胞分离液。 |
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