【原】KI细胞系的应用前景

在细胞系中敲入报告基因是CRISPR/Cas9最常见的应用之一，本文详细介绍了报告细胞系的原理、构建策略以及应用前景，希望能给广大科研工作者提供一个比较前沿的研究思路。

1.什么是报告细胞系和报告基因？

报告细胞系是指那些用报告基因标记的稳定表达细胞系，可用于可视化、跟踪和分离目的基因。报告细胞系可通过由目的基因的启动子驱动的、带有易检测的标签（如GFP）的外源表达来产生。然而，由于外源表达水平可能对实验结果造成不可预知的影响，因此研究人员更倾向于具有内源表达报告基因。在这种情况下，通过将标签（例如GFP）敲入到目的基因的启动子下游来产生的报告细胞系是最佳的选择。

报告分子可以是荧光蛋白和发光蛋白。如绿色荧光蛋白（GFP），当它暴露于蓝色至紫外线范围内的光时就会显示亮绿色荧光；而荧光素酶（luciferase）则催化与荧光素的反应并产生光。在其他情况下，报告分子也可以是与目的基因融合的标签，例如谷胱甘肽S-转移酶（GST），组氨酸（HIS）和flag标签。针对目的基因的产物，这些标签可用于基于抗体的检测和基于亲和力的蛋白分离。

2.产生报告细胞系的敲入方案/策略

为了引入外源DNA，需要将报告基因整合进基因组。研究人员可以在靶基因启动子的下游直接引入报告基因编码序列（例如eGFP）（见图1B）。另一种策略是用报告基因编码序列替换掉靶基因的特定基因座并产生截短蛋白（见图1C）。也可以用IRES连接报告基因和目的基因，在天然转录调控机制的控制下作为单个转录物与内源基因共表达（见图1D）。此外，报告基因编码序列也可以引入到终止密码子之前的N/C末端并由内源启动子控制（图1E）。这些策略常用于产生敲入细胞模型，如图1所示。

图1: 报告基因敲入的常见策略

3.报告细胞系的应用前景

研究基因启动子的转录活性

具有内源标记基因的细胞系可以让研究人员能够在活细胞中实时跟踪蛋白质的产生和定位。这些细胞系也适用于蛋白质印迹，蛋白质分离纯化，亲和层析，免疫细胞化学和流式细胞术等。当没有好用的抗体时，利用这些细胞系也是一个好的解决办法。当内源基因被敲除的同时，报告基因通过同源重组被敲入，以达到目的基因被报告基因（例如EGFP）所取代的目的。重组后，目的基因的启动子将调节被插入的报告基因的表达。通过荧光素酶敲入来研究人SREBP1基因的转录调控就是其中一个应用例子。在这项研究中，研究人员将一份外源荧光素酶基因整合到宿主基因组的一个等位基因中，另一个等位基因被删掉目标序列中的14 bp。荧光素酶活性与HEK293-SREBP1-T2A-luciferase敲入细胞系中内源性SREBP1基因的启动子活性有着直接相关的关系。

蛋白质在细胞中的表达，定位和转运

基因表达的可视化可以通过将标签序列添加到目的基因的末端（或起始端）并产生融合蛋白来实现。然后我们就可以利用荧光来持续监测内源蛋白和重组蛋白的表达水平。利用这个荧光报告分子就可以定量任何你想要的进行定量的蛋白质。GFP-LC3 293FT报告基因敲入细胞就是一个应用例子（图3），其中GFP被添加到内源性LC3的N-末端。因此，构建敲入报告基因的GFP-LC3就可以进行GFP-LC3融合蛋白表达，且表达是由内源启动子驱动的，并不会改变靶基因的表达。内源性GFP-LC3报告系统显示细胞自噬活性的准确的鉴定和定量。内源性GFP-LC3报告系统通过应激诱导的自噬以及药物（雷帕霉素）诱导/抑制自噬研究来验证。如作者所示，游离GFP蛋白增加，其信号仍然分散，但在诱导自噬时更强，而GFP-LC3在自噬抑制时会变成点状。

图3: 293FT细胞中MAP1LC3B基因座处敲入GFP-LC3。

候选药物的目标识别和评估

KI细胞系可用于药物靶标鉴定和候选评估。一旦选择特定基因作为靶标，设计KI方案，将目的基因与敏感度高的报告基因融合（如萤火虫荧光素酶基因）的细胞模型，产生易于测量的光信号，反映目的基因转录的变化。当用适当化合物处理KI细胞系时，就可以产生反映基因表达特定变化的光信号。 因此，利用报告细胞系的测定可以做到快速筛选大量样品并排除那些具有细胞毒性或不能与细胞相互作用的化合物。其中，作为利用报告细胞系来评估药物靶标的一个例子，HELA细胞系被核蛋白（Histone 1-mtagBFP2），细胞骨架标记物（βtubulin-mClover3），和已知的自噬受体蛋白（SQSTM1-mRuby3）标记，以筛选能诱导细胞质自噬囊泡积累的激酶抑制剂（具有已知靶标），从而评估自噬囊泡的积累。研究人员用两种激酶抑制剂PLK1抑制剂BI-6727和PIM激酶抑制剂CX-6258来处理细胞，这两种激酶抑制剂会增加自噬囊泡的数量，例如一种已知的自噬抑制剂——羟氯喹（图4）。

图4: 三重标记的HELA细胞系中诱导自噬囊泡积累的激酶抑制剂的验证。

总结以上发现，通过基因敲入产生的报告细胞模型对于功能研究（例如监测基因表达和亚细胞定位）是常用的，且有利于进行高通量药物筛选。