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????? shRNA沉默Semaphorin 5A基因对恶性黑素瘤细胞系A375转移和侵袭能力的影响 张莉 李亚东 陈晨 李凌佳 谢玉燕 刘彤云 寸韡 作者单位：昆明医科大学第一附属医院皮肤科（张莉、李凌佳、谢玉燕、刘彤云）；中国医学科学院 北京协和医学院 医学生物学研究所（李亚东、陈晨、寸韡） Semaphorin 5A基因是Semaphorins家族成员，最初发现与中枢神经系统相关，之后发现其与肿瘤的侵袭转移相关。而黑素瘤的黑素细胞来源于神经嵴，早期已在黑素瘤细胞系A2058中检测到Semaphorin 5A的表达，但该基因的表达是否影响黑素瘤细胞增殖和侵袭转移，还未证实。张莉等探讨了慢病毒介导短发夹RNA（shRNA）沉默神经导向分子5A（Semaphorin 5A）基因对恶性黑素瘤A375细胞系生物活性的影响。 针对Semaphorin 5A设计2对shRNA引物及1对阴性对照引物，构建慢病毒载体，转染至人胚肾上皮HEK293T细胞系收获慢病毒，利用慢病毒感染A-375细胞系并通过嘌呤霉素筛选，成功获得稳定转染细胞系，实验分为实验组细胞（A375-shRNA1和 A375-shRNA2）、阴性对照组细胞（A375-con）及空白对照组细胞（A375）。通过反转录PCR（RT-PCR）、Western 印迹比较实验组细胞、阴性对照组细胞及空白对照组细胞Semaphorin 5A mRNA、蛋白表达水平的差异。噻唑蓝（MTT）检测细胞生长情况；侵袭试验及划痕试验比较转染前后细胞的侵袭运动能力。 结果显示 Semaphorin 5A成功转染A375细胞后，经嘌呤霉素筛选，成功获得稳定转染实验组A375-shRNA2细胞系及对照组A375 -con。反转录PCR及Western 印迹检测，干扰后实验组A375-shRNA2较对照组A375-con、A375 Semaphorin 5A的转录水平及蛋白表达水平表达下调。MTT实验结果显示，A375-con与A375细胞生长差异无统计学意义，A375-shRNA2细胞生长明显减慢，与A375和A375-con比较，差异均有统计学意义。划痕实验结果显示，A375-shRNA2划痕处细胞无明显迁移，划痕未得到修复，而A375及A375-con划痕处细胞最终几乎将划痕覆盖。侵袭实验结果显示，A375组与A375-con组穿过的细胞数差异无统计学意义；而A375-shRNA2通过小室的细胞明显少于A375及A375-con组，差异有统计学意义。 同等培养条件下，慢病毒感染A375 72 h后细胞生长状态（× 100） 本研究提示慢病毒介导shRNA沉默Semaphorin 5A基因能使A375细胞中的Semaphorin 5A有效下调，并抑制细胞的生长，降低细胞的侵袭以及运动能力。 DOI：10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2016.08.011 《中华皮肤科杂志》，2016，49（8）：573-577 喜欢这篇文章，就在下面 |
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