一文搞定凝血从理论到临床应用

iceblue2589 2017-02-06

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凝血因子检测

1．参与凝血过程的凝血因子有哪些？

凝血因子（coagulable factor）也称凝血蛋白（coagulable protein）,迄今已证实有14个因子参与凝血过程，包括国际凝血因子命名委员会规定以罗马数字命名的凝血因子11个（凝血因子I~XIII，其中凝血因子IV是钙离子，凝血因子VI因被证实是因子V的活化形式而废除）以及激肽生成系统中的前激肽释放酶和高分子量激肽原。

2．凝血过程包括哪几条途径？

凝血是一系列血浆凝血因子相继酶解激活的过程，最终结果是生成凝血酶，形成纤维蛋白凝块。凝血过程一般被分为内源性凝血途径和外源性凝血途径（其中包括凝血的共同途径），两条凝血途径的主要区别在于启动方式及参加的凝血因子不同，结果形成两条不同的因子X激活通路。

（1）内源性凝血途径是指参与的凝血因子全部来自血液（内源性），这一凝血途径通常是因血液与带负电荷的异物表面（如玻璃、白陶土、胶原等）接触而启动（接触激活）；（2）外源性凝血途径是指参与凝血的因子不完全来自正常血液中，部分由组织中进入血液。这主要是指组织因子由各种途径（血管损伤、血液中细胞的释放表达等）进入血液，引起因子VII的活化，并与之构成复合物，进而激活因子X、因子II，最终形成纤维蛋白。（3）共同途径，在内源和外源凝血途径中，因子X被因子IXa、VIIIa或因子VIIa-TF所激活，之后的凝血酶生成、纤维蛋白单体在因子XIIIa和Ca²⁺作用下形成纤维蛋白过程是完全相同的。

3．内源性和外源性两条凝血途径的凝血方式有何不同？

内源性和外源性凝血途径的主要不同在于：①启动方式不同，内源性凝血途径启动于接触活化，即由因子XII接触带负电荷的物质被激活开始，外源性凝血途径由受损的血管壁释出组织因子启动；②激活因子X的复合物不同，内源性凝血途径由因子IXa,VIIIa,Ca离子形成的复合物激活因子X。外源性凝血途径由因子IIIa,VIIa，Ca离子形成的复合物激活因子X；③参与因子及所需时间不同，内源性凝血途径参与的凝血因子多，反应步骤复杂，需要3~8分钟，外源性凝血途径参与的因子少，反应步骤简单，所需时间不到10秒。

实验性问题

1．凝血酶原时间（PT）测定几种报告方式有何不同？PT结果的报告方式包括①秒数、②PT比值：即病人PT测定秒数除以正常平均PT数的比值、③活动度：在以不同稀释度的血浆制成的PT标准曲线上按病人秒数读取相应的活动度、④国际正常化比值INR，共四种方式。

2．INR系统是怎样一个概念？INR系统主要应用于口服抗凝剂患者的用药监测上。因为不同的PT试剂组织凝血活酶的来源不同所以试剂敏感性不同导致测定同一标本PT结果的没有可比性，前面三种报告方式均无法解决这一问题，INR的报告方式则解决了这一问题。INR=PTR^ISI，其中的ISI值是指PT试剂的国际敏感度指数，理论上任意试剂测同一标本的PT所得的INR值理论上是相等的，这样就建立了PT结果的可比性。使用INR应注意几点：①ISI值越高，INR变异越大，所以口服抗凝剂监测时应尽可能选用ISI值接近1.0的试剂，以获得较好的精确性；②INR的局限性——不适用于以下情形：口服抗凝剂初期的病人血浆，肝病凝血因子缺陷病人血浆，非抗凝治疗而PT延长的病人血浆。

3．进行PT测定的同时如何演算纤维蛋白原浓度值？PT测定完后纤维蛋白原会转变成纤维蛋白，其形成的浊度与纤维蛋白原的含量成正比，因此不需任何试剂，即可由产生的浊度直接推算出纤维蛋白原的含量。但演算法的应用必须注意一个前提：当血浆的Fbg 含量在正常范围时，该法与经典的Clauss法无显著差异，但Fbg含量超出正常范围时，它的结果与Clauss法相差太大，所以演算法只能作为筛选试验，如果Fbg含量超出正常仍然需要更准确的Clauss定量法。

4．常用的凝血筛选试验有哪些？（1）凝血酶原时间（PT），外源凝血系统的筛选试验，反映血浆中凝血因子I、II、V、VII、X水平的试验，其INR的报告方式用于口服抗凝剂的筛选。（2）活化部分凝血活酶时间测定（APTT），内源凝血系统的筛选试验，反映血浆中凝血因子VIII、IX、XI、XII水平的试验，常用APTT对肝素抗凝治疗进行监测。（3）凝血酶时间（TT），TT时间的延长反映肝素或类肝素物质增多，AT-III活性增高，纤维蛋白原的量和质异常。（4）纤维蛋白原定量（Fbg）,用凝血酶法测定Fbg含量所用试剂与TT相同都是凝血酶但浓度要远远高于TT，这是为了防止标本中肝素的干扰重点检测Fbg浓度。临床上主要用于先天性纤维蛋白原异常，弥漫性血管内凝血和严重肝脏疾病，以观察纤维蛋白原减少的程度。在糖尿病、心脑血管病、烧伤、手术后和某些急性传染病，血浆纤维蛋白原可能增高，血液凝固性有增强的倾向。

临床性问题

1．凝血酶原片段1+2（F₁₊₂）测定的临床意义？血浆因子Xa可使因子II分子中的Arg(273)-Tyr(274)及Arg(322)-Ile(323)间肽键同时被裂解，以N端释放出片段F₁₊₂，即Ala(1)-Arg(273);然后激活生成的凝血酶再反馈裂解酶原本身，释放出片段1（F1）即Ala(1)-Arg(155)及片段2（F2）即Ser(156)-Arg(273),由此可见F1+2是反映凝血酶原酶的活性，是因子II的分子标志物，在深静脉血栓形成、肺栓塞、弥散性血管内凝血、遗传性蛋白C缺乏症时F1+2升高，而在口服抗凝剂患者F1+2减低，可作为口服抗凝剂的监测指标之一。

2．证实凝固亢进状态和血栓倾向的早期指标有哪些？（1）凝血酶原片段1+2（F1+2）：直接反映凝血酶的生成全量，反映凝血酶生成的最敏锐指标；（2）凝血酶抗凝血酶复合物（TAT）：TAT复合物的形成是凝血酶已生成的分子标志物；（3）纤维蛋白肽A（FPA）：凝血酶作用于纤维蛋白原的早期产物，反映凝血酶生成的敏感指标；

3．在诊断血友病过程中，要排除与血友病相关联的其它凝血因子缺乏症，考虑做哪些试验以鉴别诊断？（1）出血时间及vWF:Ag测定，出血时间延长和vWF:Ag减低有助于诊断VWD型；（2）凝血酶原时间测定和蝰蛇毒时间测定，两者均延长有助于排除因子X缺乏；（3）复钙交叉试验和因子VIII抗体测定，有助于排除获得性因子VIII缺乏。

4．诊断肝病时，对病情和判断预后有价值的止凝血指标有哪些？推荐的指标有：①因子VII：C和II：C减低，先于肝功能异常，可作为肝病早期诊断的指标之一。②Fg和因子V：C减低，反映肝病严重，或进入肝硬化。③异常凝血酶原增高是诊断原发性肝癌的参考指标之一。④因子VIII：C和vWF:Ag水平越高，反映肝病越严重，因子VIII：C降低提示并发DIC。⑤因子XIIa:Ag、ATIII的水平低于35%或Plg的水平低于20%提示预后不良。肝病时常呈多个因子的联合变化，故需要综合分析。

抗凝因子检测

理论性问题

1．血液中主要生理性抗凝因子有哪些？血液中的抗凝因子主要有三个体系：抗凝血酶(antithrombin, AT)、蛋白C系统和组织因子途径抑制物。1）抗凝血酶(antithrombin, AT)是主要的生理性血浆抗凝物质，尤其对凝血酶的灭活能力占所有抗凝蛋白的70~80%。AT的抑酶谱很广，除凝血酶外，它还能抑制凝血因子Xa、IXa、XIa、XIIa以及纤溶酶、胰蛋白酶、激肽释放酶等。肝素作用于AT的赖氨酸残基可以大大增强AT的抗凝血酶活性（2000倍以上）（2）蛋白C系统除蛋白C（protein C, PC）外，还包括蛋白S（protein S, PS）、血栓调节蛋白（thrombomodulin, TM）和内皮细胞蛋白C受体（endothelial protein C receptor, EPCR）.（3）组织因子途径抑制物（tissue factor pathway inhibitor, TFPI）调节TF-VIIa参与的凝血作用.TFPI可以直接抑制活化的X(Xa),并以依赖Xa的形式在Ca²⁺存在条件下抑制TF/VIIa复合物。

2．病理性的抗凝物质有哪些？（1）类肝素抗凝物：多种疾病可产生此类物质，它具有抑制因子V、VIII、X和凝血酶活性的作用。（2）狼疮性抗凝物质：该类物质是一种与血栓形成、血小板减少和周期性流产相关的免疫球蛋白，是在某些病理情况下产生，此种物质属于IgG或IgM,可抑制因子XIIa和IXa。抑制基于磷脂的凝血试验，包括PT和APTT。（3）凝血因子抑制物：常见于血友病甲患者，长期接受因子VIII制剂治疗后，产生因子VIII的抗体。

3．活化蛋白C（APC）的生理功能？激活的蛋白C（PC）称活化蛋白C（APC），具有明显抗凝血栓作用。在凝血过程中产生的凝血酶可与未受损血管内皮细胞上受体之一血栓调节蛋白（thrombomodulin, TM）结合，从而激活PC，这一作用是未结合TM凝血酶激活PC的20000倍。

实验性问题

1．抗凝系统的成分在血凝仪中主要采取哪种检测方法？自动血凝仪对抗凝和纤溶成分的检测以发色底物法为主，其原理是通过人工合成与天然凝血因子相似的一段氨基酸排列顺序并含有特定作用位点的小肽，并将可水解产色的化学基团与作用位点的氨基酸相连。测定时由于凝血因子具有蛋白水解酶的活性，它不仅作用于天然蛋白质肽链，也能作用于人工合成的肽段底物，从而释放出产色基团，使溶液呈色。产生颜色的深浅与凝血因子活性成比例关系，故可进行精确的定量。目前人工合成的多肽底物有几十种，最常用的是对硝基苯胺，呈黄色，可用405nm波长进行测定。

2．口服抗凝治疗药物主要监测方法？PT实验是最常用的监测方法，用于监测由口服抗凝药物（华法令等）引起的维生素K依赖性因子II、VII和X的功能性水平变化。

3．静脉肝素抗凝治疗监测方法？小剂量皮下肝素（小于12500U/d）不能可靠地产生抗Xa因子活性，无需监测，皮下应用超过12500U/d或静脉用药必须监测，肝素皮下应用时APTT测定采血时间应在注射后4~6h。调整APTT为正常对照的1.5~2.5倍为宜，不应超过100秒。APTT测定的敏感范围为0.1~1.0U/ml，适用于深静脉血栓形成、不稳定心绞痛和急性心肌梗塞溶栓后静脉肝素的监测，此时要求目标肝素浓度约为0.3~0.7U/ml。

4．使用肝素抗凝治疗时为何要监测ATIII的量？肝素是ATIII的辅助因子，两者结合后，ATIII的生物效应，即灭活凝血酶的速率可提高1000~2000倍，但最终抑制丝氨酸蛋白酶的效应还是取决ATIII的量。当ATIII的活性为70%时，肝素的作用约降低65%；当ATIII的活性为50%时，肝素的作用只有原来的1/5。说明当体内ATIII活性明显降低时，单纯应用肝素治疗，其疗效受到明显影响，所以当检测发现ATIII活性低于50%，肝素效应不与预见相一致时，要考虑补充ATIII。

临床性问题

1． ATIII测定的临床意义？i. 遗传性ATIII缺乏可分为两型：①CRM^-型，即抗原与活性均下降。②CRM⁺型，抗原正常，活性下降。ii. 获得性ATIII缺乏：①ATIII合成降低，见于肝脏疾病、肝功能障碍，主要见于肝硬化、重症肝炎、肝癌晚期，常与疾病严重度相关，可伴发血栓形成。②ATIII丢失增加，见于肾病综合症等。③ATIII消耗增加，见于血栓前期和血栓性疾病。iii. ATIII水平增高：在血友病A和血友病B、口服抗凝药物、使用黄体酮类药物时有报道ATIII水平增高。

2．什么是活化蛋白C抵抗性（APC resistance，APCR）现象？在正常情况下，血浆中如果加入APC，由于APC裂解FVa和FVIIIa, 活化的部分凝血活酶时间（APTT）应延长。如果对APC抗凝反应低下，称为APCR现象。发生的基础是FV基因的单个位点突变（核苷酸序列第1691位G→A）导致FV分子氨基酸序列第506位Arg(R) →Gln(Q)(FV R506Q)。该突变亦称FV Leiden突变。突变的FVa虽然保持着促凝活性，但对APC的裂解作用的敏感性大大降低。凝血酶形成速度加快，又反馈性激活FV、FVIII。凝血途径活化加速，伴降解FVIIIa的APC辅因子活性降低，APCR作用增强，导致高凝状态形成。

纤溶活性检测

1．何谓纤溶系统，主要包括哪些成份？纤维蛋白溶解系统（fibrinolytic system）简称纤溶系统，是指纤溶酶原经特异性激活物使其转化为纤溶酶(plasmin,PL)，以及PL降解纤维蛋白和其他蛋白的过程。纤溶过程是一系列蛋白酶催化的连锁反应，是正常人体的重要生理功能，它与血液凝固存在着既矛盾又统一的动态平衡关系，其主要作用是将沉积在血管内外的纤维蛋白溶解而保持血管通畅，防止血栓形成或使已形成血栓溶解，血流复通。纤溶系统主要有纤溶酶原、纤溶酶原激活物、纤溶酶及纤溶抑制物等蛋白酶组成。

实验性问题

1．原发性纤溶和继发性纤溶的实验室指标有何不同？原发性纤溶：纤维蛋白肽A（FPA），D-二聚体以及血涂片上破碎和异形红细胞的发生率正常，FDP增高但D二聚体正常此是与继发性纤溶的重要鉴别点。继发性纤溶主要见于弥散性血管内凝血，FDP和D二聚体都会增高。

临床性问题

1．原发性纤溶和继发性纤溶的发病机制有何不同？两者的发病机制有所不同，原发性纤溶是由于循环血管内皮细胞及（或）组织中血管内皮细胞受损，大量t-PA及（或）u-PA释放，水解纤溶酶原，使其转化成纤溶酶，后者使纤维蛋白原降解。继发性纤溶是通过内激活途径，也就是说先有致病因子激活因子XII，因子XII转变为因子XIIa和XIIf，因子XIIf可激活激肽释放酶原，使后者转化为激肽释放酶（KK），XIIa、XIIf和激肽释放酶（KK）都可以水解纤溶酶原，使其转化成纤溶酶，使纤维蛋白原和纤维蛋白降解。继发性纤溶最常见于弥散性血管内凝血。