VITEK 2 Compact全自动微生物分析系统检测亚胺培南耐药鲍曼不动杆菌对阿米卡星的准确性评估杨银梅， 陈 斌， 彭颖仪， 叶惠芬， 陈惠玲， 黄小媛 （广州医科大学附属广州市第一人民医院检验科，广东 广州 510180） 摘要：目的 评价VITEK 2 Compact全自动微生物分析系统（简称VITEK 2 Compact）检测亚胺培南耐药鲍曼不动杆菌对阿米卡星药物敏感性试验结果的准确性，并了解其16S rRNA甲基化酶基因的存在情况。方法 分别采用VITEK 2 Compact、纸片扩散法、E-test法检测72株临床分离的耐亚胺培南鲍曼不动杆菌和15株亚胺培南敏感的鲍曼不动杆菌对阿米卡星的敏感性，同时采用聚合酶链反应（PCR）检测其16S rRNA甲基化酶armA基因。结果 在72株耐亚胺培南鲍曼不动杆菌中，纸片扩散法和E-test法的结果均一致；有69株细菌VITEK 2 Compact 检测最低抑菌浓度（MIC）为4～≥64 μg/mL，而纸片扩散法和E-test法结果均为耐药；有3株细菌VITEK 2 Compact检测MIC为≤2 μg/mL，纸片扩散法和E-test法有2株敏感；有59株细菌出现双圈耐药现象。在纸片扩散法及E-test法检测为阿米卡星耐药的70株鲍曼不动杆菌中，armA基因阳性率为92.9%（65/70）。15株亚胺培南敏感鲍曼不动杆菌中，VITEK 2 Compact对阿米卡星的MIC均≤2 μg/mL，纸片扩散法和E-test法的阿米卡星药物敏感性试验结果与VITEK 2 Compact一致，均为敏感。结论 VITEK 2 Compact在检测耐亚胺培南鲍曼不动杆菌对阿米卡星的敏感性时会出现不准确的结果，双圈耐药现象可能与携带16S rRNA甲基化酶基因armA有关。 关键词：鲍曼不动杆菌；亚胺培南；阿米卡星；armA基因 全自动微生物鉴定及药物敏感性分析系统能在较短时间内完成细菌鉴定和药物敏感性分析，极大地缩短了临床病原微生物的检测周期。有研究显示在检测鲍曼不动杆菌对阿米卡星的敏感性时，VITEK 2 Compact全自动微生物分析系统（简称VITEK 2 Compact）检测的最低抑菌浓度（minimal inhibitory concentration，MIC）为8 或16 μg/mL时就需采用其他替代方法，如纸片扩散法进行测定［1］，而VITEK 2 Compac的检测结果显示对阿米卡星的敏感性较高，而且部分菌株MIC≤8 μg/mL。因此，我们对VITEK 2 Compact检测亚胺培南耐药鲍曼不动杆菌对阿米卡星MIC的准确性进行了评价。 材料和方法一、菌株来源 72株耐亚胺培南鲍曼不动杆菌和15株亚胺培南敏感鲍曼不动杆菌分离自广州医科大学附属广州市第一人民医院2012年1月至2014年4月各种临床样本，样本种类包括痰、支气管纤维镜冲洗液、血液、脓液、各种分泌物、尿液和脑脊液等。所有菌株均采用VITEK 2 Compact 及配套API 20NE鉴定条进行鉴定。质控菌株为大肠埃希菌（ATCC 25922）。 二、试剂与仪器 纸片扩散法药物敏感性试验纸片购自英国Oxoid公司，E-test纸片购自瑞典AB BIODISK公司。聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）试剂购于大连宝生物公司。引物由上海生工公司合成。VITEK 2 Compact及配套药物敏感性卡为法国生物梅里埃公司产品。MyCycler PCR扩增仪、PowerPac Basic电泳仪为美国BIORAD公司产品。UVI progold凝胶成像系统为英国UVI公司产品。 三、方法 1.体外药物敏感性试验 （1）VITEK 2 Compact：采用 VITEK 2 Compact及配套ASTGN13药物敏感性卡测定所有87株鲍曼不动杆菌的MIC，严格按仪器操作规程进行，AST-GN13药物敏感性卡上阿米卡星报告的浓度范围为≤2～≥64 μg/mL；（2）纸片扩散法：试验结果按照美国临床实验室标准化协会（the Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）2012年版标准（M02-A11、M100-S22）判读；（3）E-test法：严格按试剂说明书进行操作，质控菌株为大肠埃希菌（ ATCC 25922）。 2.16S rRNA甲基化酶基因armA检测 （1）模板DNA的提取：采用Omega 系列 plasmid mini kit，严格按试剂盒说明书进行操作；（2）PCR扩增：armA引物序列根据文献［2］设计，引物为5'-CCGAAATGACAGTTCCATC-3'和5'-GAAAATGAGTGCCTTGGAGG-3'，PCR产物长度为846 bp ，退火温度为55 ℃，PCR反应体系为50 μL。利用琼脂糖凝胶电泳分析PCR扩增产物。含armA片段的PCR产物送上海生工公司测序，测序结果与GenBank中Blast进行同源分析（http：//www.ncbinlm. nih. gov/blast）。 结 果一、体外药物敏感性试验结果 纸片扩散法和E-test法检测所有87株鲍曼不动杆菌对阿米卡星的药物敏感性试验结果全部相符。72株耐亚胺培南鲍曼不动杆菌中，有18株VITEK 2 Compact 检测结果为耐药（MIC≥64 μg/mL），其中7株出现双圈现象；有51株VITEK 2 Compact检测结果为敏感或中介（MIC为4～32 μg/mL），全部出现双圈现象；上述69株细菌纸片扩散法和E-test法检测全部为耐药。VITEK 2 Compact检测MIC为≤2 μg/mL的3株细菌中有2株纸片扩散法和E-test法检测结果为敏感，其中1株出现双圈现象，见图1。纸片扩散法和E-test法总计有59株细菌出现双圈耐药现象。VITEK 2 Compact、纸片扩散法和E-test法检测15株亚胺培南敏感鲍曼不动杆菌对阿米卡星的药物敏感性试验结果均为敏感，其中VITEK 2 Compact的MIC≤2 μg/mL。 二、16S rRNA甲基化酶基因armA的检测结果 在纸片扩散法及E-test法检测结果为阿米卡星耐药的70株鲍曼不动杆菌中，armA基因阳性率为92.9%（65/70），部分PCR产物电泳结果见图2。15株亚胺培南敏感鲍曼不动杆菌的armA基因均为阴性。  图1 纸片扩散法与E-test法药物敏感性试验结果 注：箭头所示菌株出现双圈耐药现象  图2 armA基因PCR产物的电泳结果 注：M为DNA Marker；1～3、5、6为armA基因为阳性；4为armA基因阴性 三、armA基因PCR产物的测序结果 对armA基因阳性PCR扩增产物进行测序，测得序列结果均为16S rRNA甲基化酶基因armA，与GeneBank中的armA基因（EF158302）有100%的同源性。 讨 论近年来，鲍曼不动杆菌已成为临床继铜绿假单胞菌之后引起医院感染的重要非发酵菌，而且自1991年美国第1次发现耐碳青霉烯类抗菌药物的鲍曼不动杆菌以来，欧洲、北美以及中国等地区和国家耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌的检出率逐年递增［3-7］。因此，鲍曼不动杆菌感染的诊断和防治也越来越受到临床医生、感染控制专家和检验人员的重视。 本实验室常规使用VITEK 2 Compact进行体外药物敏感性试验，其革兰阴性杆菌药物敏感性试验卡GN13的说明书中指出：在检测鲍曼不动杆菌对阿米卡星的敏感性时要采用其他方法进行检测，其试验本身存在方法局限性。目前，本实验室通过VITEK专家系统将阿米卡星的药物敏感性试验结果隐藏，不报告给临床。本研究分离的耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌对临床常用的抗菌药物几乎全部耐药。阿米卡星是氨基糖苷类抗菌药物中抗菌活性较强的药物，且其抗菌机制不同于碳青霉烯类抗菌药物，但本研究发现耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌对阿米卡星的耐药性很严重，敏感性只有2.8%。本研究结果显示VITEK 2 Compact 检测阿米卡星MIC≥64 μg/mL的鲍曼不动杆菌，其结果与纸片扩散法和E-test法相符；MIC为4～32 μg/mL的鲍曼不动杆菌，纸片扩散法和E-test法检测结果均为耐药；MIC≤2 μg/mL的3株鲍曼不动杆菌中有2株纸片扩散法和E-test法提示为敏感。因此，在实际工作中，当VITEK 2 Compact 检测结果为MIC≤2 μg/mL的菌株，用其他方法进行确认后报告给临床，对指导临床治疗有一定的意义。 VITEK 2 Compact使用微量肉汤稀释法检测MIC值，仪器的读数器每隔一定时间通过光扫描获取每个小孔透光率变化值，卡内设有阳性对照孔，当阳性对照孔达到阈值时，仪器结合数据库的每种细菌/抗菌药物组合的标准曲线进行分析给出MIC值［8］。本研究发现所有VITEK 2 Compact检测结果与纸片扩散法及E-test法不相符的菌株均出现双圈耐药现象。有学者对双圈耐药现象和造成VITEK 2 Compact对阿米卡星检测出现误差的原因进行了研究。王莹等［8］报道用 VITEK 2 Compact 检测鲍曼不动杆菌对阿米卡星会出现假敏感现象，可能由 16S rRNA甲基化酶基因armA表达介导；而张晓文等［9］也报道鲍曼不动杆菌中双圈耐药现象与armA基因诱导型表达有关。 氨基糖苷类抗菌药物通过与细菌30S核糖体亚单位的16S rRNA位点不可逆结合，导致细菌蛋白质合成受阻而死亡。鲍曼不动杆菌对氨基糖苷类抗菌药物的耐药机制主要有外膜孔蛋白表达的缺失、药物外排泵的表达、核糖体结合位点的改变、产生氨基糖苷修饰酶和16SrRNA甲基化酶等［10］。16S rRNA甲基化酶基因编码的甲基化酶是近年来发现的氨基糖苷类抗菌药物耐药的新机制。16S rRNA甲基化酶基因于2002年在波兰首次发现于氟劳地枸橼酸杆菌中［10-12］，之后在亚洲、欧洲、非洲和北美等世界各地的多种革兰阴性杆菌中被发现，16S rRNA甲基化酶基因包括多种亚型，其中以armA基因较为常见［10-13］。16S rRNA甲基化酶通过甲基化16S rRNA A位点的碱基，使氨基糖苷类抗菌药物不能与其作用靶点结合，甲基化酶修饰的是所有氨基糖苷类抗菌药物的共同作用位点，从而导致细菌对氨基糖苷类抗菌药物高水平耐药，耐药菌的MIC值可高达512～1 024 mg/L。本研究结果显示纸片扩散法和E-test法检测结果为阿米卡星耐药的70株鲍曼不动杆菌中有65株（92.9%）armA基因阳性。E-test法既与纸片扩散法一样操作简单，也能直接读取MIC值，因此应用较为广泛［14-15］。PCR结果也从分子水平上支持了上述2种检测方法的准确性。 综上所述，本研究证实VITEK 2 Compact在检测耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌对阿米卡星的敏感性时结果不可靠。所有VITEK 2 Compact检测结果与纸片扩散法及E-test法不相符的菌株均出现双圈耐药现象。同时这些耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌对阿米卡星的耐药性很严重，其耐药基因armA的阳性率也很高。 参考文献 ［1］FANJAT N，LECLERCQ A，JOOSTEN H，et al. 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Abstract：Objective To evaluate the accuracy of VITEK 2 Compact automated microorganism analysis system for the determination of imipenem-resistant Acinetobacter baumannii to amikacin，and to investigate the existence of 16S rRNA methylase gene. Methods The drug susceptibilities of 72 isolates of imipenem-resistant Acinetobacter baumannii and 15 isolates of imipenem-sensitive Acinetobacter baumannii to amikacin were determined by VITEK 2 Compact，Kirby-Bauer method and E-test. 16S rRNA methylase armA gene was determined by polymerase chain reaction（PCR）. Results Among the 72 isolates of imipenem-resistant Acinetobacter baumannii，the drug susceptibility results were consistent between Kirby-Bauer method and E-test. The minimal inhibitory concentration （MIC）of 69 isolates was 4-≥64 μg/mL by VITEK 2 Compact，while the results of Kirby-Bauer method and E-test showed being resistant. The MIC of 3 isolates were ≤2 μg/mL by VITEK 2 Compact，while there were 2 isolates being sensitive by Kirby-Bauer method and E-test. The resistant double-ring phenomenon was found in 59 isolates. The positive rate of carrying armA gene was 92.9%（65/70）by Kirby-Bauer method and E-test. Among the 15 isolates of imipenem-sensitive Acinetobacter baumannii，the MIC to amikacin was ≤2 μg/mL，and the results were in accordance with those of Kirby-Bauer method and E-test. Conclusions VITEK 2 Compact is not reliable for the determination of imipenem-resistant Acinetobacter baumannii toamikacin. The resistant double-ring phenomenon might be related with carrying armA gene. Key words：Acinetobacter baumannii；Imipenem；Amikacin；armA gene 文章编号：1673-8640（2016）010-0907-04 中图分类号：R378.99 文献标志码：A DOI：10.3969/j.issn.1673-8640.2016.010.016 基金项目：国家自然科学基金项目（81201163）；广东省医学科研基金项目（B2014341） 作者简介：杨银梅，女，1966年生，主任技师， 主要从事临床微生物检验及细菌耐药性研究。 通讯作者：陈 斌，联系电话：020-81048451。 收稿日期：（2015-11-12） |
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