wb中常见的7大错误分享 “良好的开始是成功的一半”，其实，对于WB这座大厦而言，好的蛋白样品的准备无疑是打下了良好的地基，而坏的样品则奠定了“豆腐渣”工程的基调。因而，正确的蛋白质提取和样品制备是至关重要的。 尽管每个实验室都有相应的样品准备方法，但做实验的小伙伴在制备蛋白样品时仍需要考虑以下因素：盐离子浓度、缓冲液种类、抑制剂、还原剂和加热时间等。一个最佳Protocol应该最大程度上提高蛋白质的溶解度和稳定性，有助于WB更好得可视化目的蛋白。 上样前，要谨记完美的凝胶和好的样品才是最配的，不然只能使之前的种种努力付之东流。为了避免前功尽弃，在使用SDS-PAGE凝胶前需要仔细检查并警惕以下情况出现： 1）凝胶中不仅出现气泡，而且孔道之间并不均一，这会严重影响蛋白质在凝胶中的迁移。2）当凝胶边缘开始收缩时，说明凝胶已经变得非常干燥，需要重新配制。3）凝胶凝固时间太短，仍处于可以流动状态。为了确保凝胶完全凝固，可将胶轻轻倾斜来进行检查。 WB中，转膜是对Western最终结果影响最大的一步，转膜质量的好坏直接决定了实验结果的好坏。那么转膜中又存在哪些容易被人忽视的陷阱存在呢？ 1）徒手抓蛋白转移膜。毫无疑问，此时手指上的油脂与蛋白会封闭转移膜，容易产生背景污斑影响实验结果。因此建议实验全程要用手套及镊子。 2）忽略了分离胶的上下方向以及膜的正反面。通常使用预染Marker可解决此问题，此外还可以将胶和膜的一角剪掉来进行区分。 3）转移膜和凝胶不幸干涸了。一般转膜前可将凝胶放在缓冲液里平衡一下防止胶变形，也有助于进一步去掉有碍转膜的杂质。也可在这一步通过浸泡对蛋白复性并直接检测蛋白活性。 4）转移缓冲液中甲醇浓度过高，可使蛋白质与SDS分离，从而沉淀在凝胶中，同时也会使凝胶收缩或变硬，抑制高分子量蛋白的转移。此时可降低甲醇浓度或用乙醇或异丙醇代替。 通常为了检测转膜是否成功，可用丽春红进行染色。即将膜放入TBST中清洗一次，而后将其置于丽春红染色工作液中，室温下摇动染色5min并用大量水洗膜，直至水变清无色，蛋白条带清晰。 同样，一些让人头疼的问题也随之而来。丽春红染色后，目的蛋白条带常常黯淡无光，甚至有时不翼而飞。而这些大多是由以下原因造成的： 1）蛋白转膜的时间太短或者处于热度较高的环境之中，此时只需在一个较低的电压下转膜较长的时间即可； 2）在处理“滤纸-凝胶-膜-滤纸”的三明治时，使得膜和胶与对方的背后滤纸相接触导致电流不能通过膜，从而转膜无效。因而，三明治结构中，膜、胶、滤纸的大小最好是一样的。 对于国内的大多数实验室来讲，做western blot实验选择抗体是个头疼的问题。原因很简单，买进口抗体捉襟见肘，买国产抗体得需要大无畏的勇气。然而要想与WB实验进行愉快的玩耍，就一定要确保抗体的高质量，此时一些可信赖的品牌如Proteintec Group、Epitomics、Abgent、Abnova等便是不错的选择。 另外，还有个最安全可靠的办法就是直接参考文献中使用的抗体，但是仍需要注意3点：一是文章的可靠性，要参考IF高于3分的文章；二是实验必须是同一类实验，别人做IHC的抗体做WB是没有意义的；三是检测的是内源蛋白还是外源蛋白，一般只有内源蛋白的Western blot才有参考意义，但如果同时做了过表达和敲减，也是可以的。 抗体无论是保存还是运输都应尽可能的避免反复冻融。收到抗体后，无论是液体还是冻干粉状态，请务必在4℃,12000rpm,离心3分钟，，再打开管盖进行分装和保存（如果抗体体积小于50ul，请延长离心时间至5分钟，以保证全部抗体均离心下来）。 抗体分装的量以一次实验用完为好，最少不能少于10ul每份。因为分装体积越小，抗体的浓度越可能会受到蒸发及管壁吸附的影响。复融后的分装抗体如果一次用不完，将剩余母液保存在4℃，避免再次冻起来。抗体工作液应该现配现用，4℃保存尽量不要超过1天。 抗体中的叠氮化钠（终浓度0.02% (w/v)，65Da）尽管会防止微生物污染，但仍会对实验产生影响。又因IgG的分子量是150kDa（IgM约600kDa），可使用截留分子量为14kDa的滤膜将叠氮化钠从抗体中去除。 一般，在很短时间里曝光产生高背景多是由含HRP-抗体浓度过高，洗涤不充分或封闭不充分造成的。另外，如果发光试剂不好，也会制造背景颜色较深，这种情况在较长时间曝光的情况下更为明显。 因而，WB曝光时要注意掌控好时间，时间太长会使得背景深，过短又会不容易曝出条带或曝出条带很浅，所以需要优化出适合自己靶蛋白和实验体系的最佳曝光时间。 Western blot 操作流程 实验原理： Western,也称Western blot、Western blotting、Western印迹，是用抗体检测蛋白的重要方法之一。Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳,被检测物是蛋白质,“探针”是抗体,“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品,转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上,固相载体以非共价键形式吸附蛋白质,且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原,与对应的抗体起免疫反应,再与酶或同位素标记的第二抗体起反应,经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。 内参: WB过程监测以及目的蛋白定量的标准;最重要和最不可或缺的对照就是内参照。 1.内参可检测整个WB实验过程及体系是否正常工作,如果一个实验连内参照都出不了阳性结果的话（在内参抗体有效的情况下）,那么这个体系就是存在问题的； 2、起半定量的标准的作用,内参一般选择管家基因编码表达的蛋白,在很多组织和细胞中都是稳定表达的,因此可以作为检测靶蛋白表达量的标准；
实验步骤 一、蛋白样品制备（组织中总蛋白的提取） 第一步： 法（1）敲取0.07-0.1g组织+400-500ul裂解液，放入打样管，放入打样机打样。 法（2）实验室研钵研磨：取稍大于0.1g的样品放入研钵中，来回磨，至粉末状，用枪头刮取收集入离心管。 注：任何操作都要在液氮中进行，并且要将枪头和离心管提前泡在液氮中。 第二步：取出的样品放置冰上1-2h（中间混匀5-6次）直至裂解完全。 第三步：样品离心*2，取上清于新的EP管中。 （离心条件：13000rpm，4℃，30min） 注：离心机提前预冷至4℃。 二、蛋白含量的测定 第一步：在96孔板第一列1-8分别为浓度为0,1,2,4,6,8,9,10倍的蛋白标准液+水=10或20ml，再加上5倍稀释的考马斯亮蓝染液200ml。 第二步：在96孔板后面几列依次加入稀释的蛋白样品或原液10-20ml以及5倍稀释的考马斯亮蓝染液200ml。 注：原液浓度太高时进行稀释，用裂解液稀释。 三、电泳 第一步：清洗玻璃板 第二步：配胶 （1）玻璃板对齐后放入夹中卡紧,然后垂直卡在架子上准备灌胶。 （2）配分离胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。待胶面升到玻璃板3/4位置时即可。然后胶上加一层水，液封后的胶凝的更快。 注：加水液封时要很慢，否则胶会被冲变型。 （3）当水和胶之间有一条折射线时，说明胶已凝了。倒去胶上层水并用吸水纸将水吸干。配浓缩胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。将剩余空间灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中。待到浓缩胶凝固后，两手分别捏住梳子的两边竖直向上轻轻将其拔出。 注：插梳子时要使梳子保持水平。 （4）用水冲洗一下浓缩胶，将其放入电泳槽中。（小玻璃板面向内，大玻璃板面向外。若只跑一块胶，槽另一边要垫一块塑料板且有字的一面面向外。） 第三步：上样 （1）测完蛋白含量后，计算含50mg蛋白的溶液体积即为上样量。适量蛋白加入4：1 5*Loading Buffer于离心管，100℃水中煮5min使蛋白变性。放置冰上3min，离心15min，13000rpm，4℃。 （2）加足够的1*电泳缓冲液后开始准备上样。（电泳液至少要漫过内测的小玻璃板。）用微量进样器贴壁吸取样品，将样品吸出不要吸进气泡。将加样器针头插至加样孔中缓慢加入样品。（加样太快可使样品冲出加样孔，若有气泡也可能使样品溢出。） 第四步：电泳 浓缩胶80V电压跑20分钟，可多跑几分钟；分离胶180V电压跑至底端。 第五步：停止电泳 纯水冲洗玻璃板，取胶，清洗切去浓缩胶，在Marker下方切角做标记，将胶泡在清水中。 四、转膜（跑胶时准备转膜用品,最主要赶气泡） 第一步：剪PVDF膜,并提前切个角，甲醇中泡2-3min。 第二步：将膜、海绵、滤纸一起泡入1*转膜液中，放4℃保存。 注：转膜液可回收。 第三步：将夹子打开使黑的一面保持水平。在上面垫一张海绵垫，用玻棒来回擀几遍以擀走里面的气泡。(一手擀另一手要压住垫子使其不能随便移动。)在垫子上垫2层滤纸，一手固定滤纸一手用玻棒擀去其中的气泡。将胶盖于滤纸上，轻轻用玻棒擀去气泡。将膜用镊子盖于胶上，并除气泡。在膜上盖2层滤纸并除去气泡。最后盖上另一个海绵垫，合起夹子。整个操作在1*转膜液中进行，要不断的擀去气泡。膜两边的滤纸不能相互接触，接触后会发生短路。 第四步：将夹子放入转膜槽槽中，黑对黑,对红。电转移时会产热，过热有可能造成蛋白质的降解，同时大量产热，会使凝胶膨胀，有可能在胶和膜之间产生空隙，引起转膜不均匀，所以在转膜槽中放入冰盒，在冰水混合物中进行转膜。 注：转膜条件是电流300mA或电压70V，2h；另一个约束条件就是电压必须控制在60-70V，调节电流。 第五步：转完后将膜放入装水的小盒中冲洗，倒水后，加5%的封闭液，摇床封闭1h。 五．抗体孵育,免疫反应 第一步：回收封闭液,加入一抗,摇床30min-1h，4℃过夜,再孵育30min-1h。 第二步：一抗回收，用PBST洗，洗5次，每次5min。（少时多次） 第三步：加二抗，孵育2h。 第四步：二抗回收，用PBST洗，洗5次，每次5min。（少时多次） 第五步：纯水冲洗5-7次，倒掉纯水，加化学发光，膜在化学发光中浸泡2-3min，成像。 实验药品试剂 1.裂解液： 母液（动物组织蛋白提取Buffer）：蛋白酶抑制剂：Pmsf（配）=100:1:1 母液常温放置；蛋白酶抑制剂和Pmsf需-20℃保存；裂解液需-4℃保存。 2.考马斯亮蓝染液，使用前用无菌水稀释。 3.转膜液的配制（1*）1L
先定容800ml，调制PH=8.3，然后+200ml甲醇，混匀。 4.蛋白电泳Buffer（5*）1L
直接定容至1L，无需灭菌和调PH；使用前稀释至1*。 5.磷酸盐缓冲液（PBS，10*）500ml
调制PH=7.4-7.5 6.PBST配制 1L的PBS+5ml 20%Tween20 7.封闭液（5%） 奶粉5g，溶于PBS，定容至1L。 注：推荐使用的奶粉：雀巢高钙奶粉或多力精低脂奶粉。 8.一抗溶于封闭液；二抗溶于PBST。 9.按照如下表格配制SDS-PAGE的浓缩胶(也称堆积胶、积层胶、上层胶)
10.根据目的蛋白的分子量大小选择合适的分离胶（下层胶）浓度
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