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中国中医研究院西苑医院 于大君① 聂莉芳① 许勇钢② 杨晓红②
摘要 目的：进一步阐明IgA肾病的发病机制以及益气滋肾颗粒对IgA肾病辅助性T淋巴细胞亚群（Th1/Th2）的影响。 方法：应用流式细胞仪分别对31例IgA肾病患者运用益气滋肾颗粒治疗前后和24例健康对照的Th1/ Th2细胞内细胞因子进行了检测。 结果：IgA肾病患者与健康对照比较，IFN-γ水平较低，而IL-4、IL-10水平高，IgA肾病患者存在Th1/Th2的失衡。益气滋肾颗粒治疗后，IFN-γ水平较治疗前升高，IL-10水平较治疗前降低。结论：益气滋肾颗粒对IgA肾病患者的Th1/Th2失衡有一定的调节作用。 关键词 益气滋肾颗粒 IgA肾病 辅助性T淋巴细胞亚群 Research of the effect of Yiqizishen Granulation on helper T lymphocyte subsets in IgA nephropathy Yu Dajun，Nie Lifang, Xu Yonggang, et al. Xiyuan Hospital, China Academy of Traditional Chinese Medicine, Beijing 100091, China Abstract: Objective: To shed light on the pathogenesis of IgA nephropathy(IgAN) and the effect of Yiqizishen Granulation on intracytoplasmic cytokines secreted by helper T lymphocyte subsets (Th1/Th2) in IgAN. Method: we measure intracytoplasmic cytokines secreted by Th1/Th2 of venous blood in 31 IgAN patients before and after treated by Yiqizishen Granulation and 24 healthy controls using flow cytometry. Results: The propotion of IFN-γof IgAN is lower than that of healthy controls. The propotion of IL-4, IL-10 of IgAN patients is higher than that of healthy controls. The abnormity of Th1/Th2 exists in IgAN patients. Conclusion: Yiqizishen Granulation can regulate the abnormity of Th1/Th2 in IgAN patients to some extent. Key words: Yiqizishen Granulation IgAN helper T lymphocyte subsets (Th1/Th2) 1.研究目的 IgA肾病是最常见的原发性肾小球疾病之一[1]，据我国的肾活检资料，IgA肾病占原发性肾小球疾病的38%-49%，居首位[2]， 40%以上的患者会发展成终末期肾脏病[3]。因此，探索IgA肾病的发病机制，从而能找到有效的治疗方法，成为近年来肾脏病学界研究的一个重要课题。对IgA肾病发病机制的研究包括多个方面，如遗传因素、IgA分子和IgA受体等。随着1986年辅助性T淋巴细胞亚群（Th1/Th2）的发现，用Th1/Th2细胞的异常可以解释许多自身免疫性疾病，如系统性红斑狼疮，多发性硬化症等[4]。IgA肾病与外来或自身抗原产生的损伤性免疫反应有关，因此，近年来许多研究试图探讨Th1/Th2的失衡在IgA肾病发病中的作用。 聂莉芳教授以益气滋肾法为治则研制的经验方-益气滋肾颗粒在临床已应用多年。临床研究证明益气滋肾颗粒不仅可以改善IgA肾病患者的症状，而且可以减少患者的血尿和蛋白尿[5]。实验研究证实该药有助于清除免疫复合物在肾小球的沉积[6]。为了进一步阐明IgA肾病的发病机制以及益气滋肾颗粒对IgA肾病Th1/Th2的影响，我们应用流式细胞仪分别对31例IgA肾病患者治疗前后和24例健康对照的Th1/ Th2细胞内细胞因子进行了检测，以期揭示益气滋肾颗粒对IgA肾病患者Th1/Th2的调节作用。 2.材料与方法 2.1材料 2.1.1病人： 自2003年2月-2003年12月共收集IgA肾病患者31例，这些患者均经过肾活检确诊。其中男性16例，女性15例，年龄15岁-57岁，平均年龄29.55±9.87岁。治疗前表现为单纯血尿者（24小时尿蛋白定量<0.15g）12人, 血尿伴蛋白尿(尿蛋白0.15-1.0 g )14人, 血尿伴蛋白尿(尿蛋白1.0 -3.5 g)5人。伴高血压者6人，服降压药（包括血管紧张素转换酶抑制剂和/或二氢吡啶类钙拮抗剂）者10人，曾服过强的松（起始剂量30mg）者1人。疾病确诊时间（肾穿刺到检测时间）0.5月-69月，中位数是8个月。不同单位肾活检病理诊断结果为轻度系膜增生者17人，局灶增生硬化者4人，局灶增生者2人，局灶坏死者1人，Lee氏分级Ⅳ级1人，Ⅲ级5人，Ⅱ级1人。治疗前后，31例患者未出现上呼吸道感染、泌尿系感染等病症。患者31例患者均属于气阴两虚证。31例患者服益气滋肾颗粒前后均检测了4个细胞因子，包括由Th1细胞分泌的γ-干扰素（IFN-γ）和白介素-2（IL-2），由Th2细胞分泌的白介素4和白介素10（IL-4、IL-10）。 2.1.2治疗药物、服药方法和疗程:上述患者在观察期间服用益气滋肾颗粒，每次服12g,每天2次，饭后1个半小时服用，疗程为3个月。益气滋肾颗粒由太子参、生黄芪、生地、旱莲草等药物组成，功在益气滋肾、凉血止血。该药由西苑医院制剂室提供。在整个观察期间，患者未用任何其它中西药物。 2.1.3对照：健康对照24人，均排除肾脏疾病。男12人，女12人，年龄26岁-40岁，平均年龄32.17±4.77岁。健康对照也检测了上述4个细胞因子：IFN-γ、IL-2 、IL-4、IL-10。 2.2实验试剂和仪器 2.2.1试剂 2.2.1.1单克隆抗体 细胞膜表面标记抗体：抗人CD4-PC5（mouseIgG1,13B8.2）及同型对照，购自美国Coulter-Immunotech公司。 细胞内细胞因子标记抗体：抗人IL-4-pe(mouseIgG1,4D9)，IL-10-fitc(mouseIgG1,8D4-8),抗人IFN-γ-fitc(mouseIgG1к,4S.B3), 抗人IL-2-pe(mouseIgG1к,4S.B3)及同型对照，购自美国DB-PharMingen公司。 2.2.1.2透膜试剂 使用细胞内细胞因子专用试剂盒（IntraPrepTM Permeabilization Reagent）,购自美国HyClone公司。 2.2.2仪器 EPICS ELITE型流式细胞仪（美国BECKMAN-COULTER公司）。 2.3方法 2.3.1细胞培养与染色：取300ul抗凝静脉血加入15µLCD4-Pc5单抗，室温避光孵育30分钟，RPMI1640洗涤一次，将细胞加入RPMI1640培养体系中（含新生牛血清10%、青霉素100IU/ml、链霉素100ug /ml、PMA50ng/ml、ionomycin1µg /ml、monensin2µM），37℃，5%CO2，孵育18小时。PBS洗涤一次，用Coulter-Immunotech公司专用细胞内细胞因子试剂进行细胞固定、透膜（按试剂盒说明书），将细胞分成3管，其中第1管同时加入抗人IL-4-pe和IFN-γ-fitc，第二管同时加入抗人IL-2-pe和IL-10-fitc，第三管加入同型对照，室温、避光30分钟，PBS洗涤一次，待测。 2.3.2流式细胞仪测定 打开流式细胞仪及氩激光光源（488nm）预热20分钟，同时，仪器自动初始化；用标准荧光微球校正光路和荧光补偿，然后依次检测标本，每份标本检测50000以上细胞；在前向散射光（FS）和侧向散射光（SS）散点图中圈定淋巴细胞群，然后分析CD4阳性细胞中IL-4-pe、IFN-γ-fitc、IL-2-pe和IL-10-fitc的表达。 2.4 统计方法 健康人与病人的性别比较用X2检验，健康人与病人的年龄、细胞因子指标比较、益气滋肾颗粒治疗前后尿液检查指标和细胞因子比例的比较用T检验。统计软件用SPSS10.1统计分析软件。 3.研究结果 IgA肾病患者组和健康对照组的性别和年龄比较 表1 IgA肾病患者组和健康对照组的性别比较
X2=0.291, P=0.590>0.05，两组间性别无显著性差异，具有可比性。
表2 IgA肾病患者组和健康对照组的年龄比较
T=-1.474, P=0.145>0.05, 两组年龄之间无显著性差异，具有可比性。
3.1 IgA肾病患者组和健康对照组Th1/ Th2的比较 表3 IgA肾病患者组和健康对照组Th细胞分泌的IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10比较
* P<0.05，**<0.01 从上表可以看出，经T检验，IgA肾病患者组和健康对照组的IFN-γ水平，有显著性差异（P<0.05），IL-4、IL-10水平有非常显著性差异（P<0.01），即IgA肾病患者与健康对照比较，IFN-γ水平较低，而IL-4、IL-10水平高，IgA肾病患者存在Th1/Th2的失衡。同时，也可以看出，IL-2水平无显著性差异（P>0.05）。 图1 IgA肾病患者组和健康对照组IFN-γ水平的比较 左图为一IgA肾病患者的IFN-γ水平，右图为一健康对照的IFN-γ水平，H2区为Th细胞中分泌IFN-γ的细胞（Th1）所占的比例，从图中可以看出IgA肾病患者的IFN-γ水平较健康对照者低。
图2 IgA肾病患者组和健康对照组IL-4水平的比较 左图为一IgA肾病患者的IL-4水平，右图为一健康对照者的IL-4水平，D2区为Th 细胞中分泌IL-4的细胞（Th2）所占的比例，从图中可以看出IgA肾病患者的IL-4水平较健康对照者高。
图3 IgA肾病患者组和健康对照组IL-10水平的比较 左图为一IgA肾病患者的IL-10水平，右图为一健康对照者的IL-10水平，E2区为Th 细胞中分泌IL-10的细胞（Th2）所占的比例，从图中可以看出IgA肾病患者的IL-10水平较健康对照者高。
3.2 益气滋肾颗粒对IgA肾病Th1/ Th2的调节作用 表4 益气滋肾颗粒治疗前后IFN-γ、IL-4、IL-10 比较
* P<0.05，**<0.01 从上表可以看出, 经T检验，益气滋肾颗粒治疗后较治疗前相比，IFN-γ水平有显著性差异（P<0.05），IL-10水平有非常显著性差异（P<0.01），而IL-4水平无显著性差异（P>0.05），即益气滋肾颗粒治疗后，IFN-γ水平较治疗前升高，IL-10水平较治疗前降低, 益气滋肾颗粒对IgA肾病患者的Th1/Th2失衡有一定的调节作用。
左图为一IgA肾病患者治疗前的IFN-γ水平，右图为该患者治疗后的IFN-γ水平，H2区为Th 细胞中分泌IFN-γ的细胞（Th1）所占的比例，从图中可以看出治疗后比治疗前IFN-γ水平有所升高。
图5 益气滋肾颗粒治疗前后IL-10水平的比较 左图为一IgA肾病患者治疗前的IL-10水平，右图为该患者治疗后的IL-10水平，E2区为Th 细胞中分泌IL-10的细胞（Th2）所占的比例，从图中可以看出治疗后比治疗前IL-10水平有所下降。 4.讨论 4.1即往文献有关于Th1/Th2失衡参与了IgA肾病发生的报道。有的研究者对IgA肾病患者血液中Th1/Th2产生的细胞因子分别进行了测量，结果显示在IgA肾病患者中，IL-2、IFN- γ均较正常对照组低，而IL-4、10均较正常组高[7，8]。本研究显示IgA肾病患者存在Th分泌的细胞因子的异常，即Th1分泌的IFN-γ降低，Th2分泌的IL-4 、IL-10的增高，这一结果与文献报道是一致的。有研究显示Th1/Th2分泌的细胞因子参与了IgA肾病特异的炎症和免疫损伤过程[9]。Th2分泌的细胞因子的增高增加了产生IgA的形式，同时也调整了IgA分子的糖基化形式[10]，在可能的这种发病机制下，细胞因子对IgA肾病的产生起了促进作用。 4.2 研究结果显示益气滋肾颗粒不仅可以减少IgA肾病患者的尿红细胞数和24小时尿蛋白定量，而且对Th1/Th2有调节作用，使IFN-γ水平提高，IL-10水平下降，对Th1/Th2的失衡有一定的调节作用，这可能与益气滋肾颗粒的益气滋肾、扶助正气作用有关。方中的太子参、生黄芪有提高机体免疫力的作用[11]，益气滋肾颗粒中这些主要成分的作用，可能会对IgA肾病患者的Th1/Th2失衡有一定的调节作用。
参考文献 1．王海燕主编: 肾脏病学 第二版 北京：人民卫生出版社 1996.708-718 2. Li LS, Liu ZH: Epidemiologic data of renal diseases from a single unit in China: analysis based on 13,519 renal biopsies. Kidney Int. 2004 Sep;66(3):920-3. 4.Stephen R.Holdsworth, A.Richard Kitching, Peter G.Tipping: Th1 and Th2 helper cell subsets affect patterns of injury and outcomes in glomerulonephritis Kidney Int 1995;55:1198-1216 5.聂莉芳,于大君,王洪霞等益气滋肾冲剂治疗IgA肾病100例临床观察 中医杂志2002；43（11）：843-844 6.聂莉芳,余仁欢,林秀彬等益气滋肾冲剂对小鼠IgA肾病肾小球免疫符合物的影响 中国医药学报 2001；16（1）：71-72 7.Itaru Ebihara, Kouichi Hirayama, Satoshi Yamamoto et al: Th2 predominance at the single-cell level in patient with IgA nephropathy Nephrol Dial Transplant 2001;16:1783-1789 8.J.W.DE Fijter,M.R.Daha,W.E.M.Shroeijers et al: Increased Il-10 production by stimulated whole blood cultures in primary IgA nephropathy Clin Exp Immunol 1998;111:429-434 9. Lim CS, Yoon HJ, Kim YS et al: Clinicopathological correlation of intrarenal cytodines and chemokines in IgA nephropathy Nephrology(Carlton) 2003;8(1):21-27 10.Stephen R.Holdsworth, A.Richard Kitching, Peter G.Tipping: Th1 and Th2 helper cell subsets affect patterns of injury and outcomes in glomerulonephritis Kidney Int 1995;55:1198-1216 11.颜正华: 临床实用中药学 北京：人民卫生出版社 1984
*本课题为国家科技部基础性工作专项资金项目的分课题之一（No.2001DEA20010） ①中国中医研究院西苑医院肾病科 ②中国中医研究院西苑医院血液实验室 地址：中国中医研究院西苑医院 北京海淀区西苑操场一号 100091
本论文发表在中国中西医结合杂志2006年9月 |
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