流式免疫表型检查诊断的长处不足与形态学互补整合

开心100mm05xkw 2017-11-07

展开全文

卢兴国吴婧妍（迪安诊断）

沈红强（浙江大学儿童医院）

形态学诊断的不足显而易见，已经在本微信公众号“感想谈5——形态学的地位与发展的路”做了介绍。形态学不足的许多方面需要流式免疫表型进行互补。

担负和执行免疫效应或组成免疫系统的细胞几乎都来自造血细胞，免疫学与血液学是紧密地交织在一起的学科。在血液病的诊断上也一样，流式细胞免疫表型检查，不仅可以鉴别细胞的系列、成熟阶段，而且可以鉴定肿瘤性细胞成份，早已成为形态学外的另一个最重要和最基本的诊断项目。

一、流式免疫表型检查方法和诊断上的优势

诸如对单个的有核细胞悬液进行大数据、多参数定量分析；自动化效率高，检测快速；灵敏度高，检测残留白血病细胞，灵敏度高达1/10^4~6；可以选择的单抗种类多，CD系列的单抗就多达300多种，没有CD编号的也很多。

在诊断上，对疾病的诊断定性优势显著。可以可靠地评判白血病细胞或淋巴瘤细胞的系列、克隆性，MDS的表达紊乱、浆细胞病良恶性增殖的鉴定等，尤其是包括形态学不能区别的相似细胞。还可以对血液肿瘤作出进一步的细化诊断与分类，如T-ALL特定类型的临时病种——早期前体T原始淋巴细胞白血病和NK细胞原始淋巴细胞白血病/淋巴瘤。

流式细胞免疫表型检查在方法上和诊断中的很多优点，包括预后评判和疾病机制等许多方面的长处，在此不一一细述。

二、流式免疫表型检查的不足

可是，流式细胞免疫表型检查的不足也很明显。

诸如理论上与实际上有一定较大的差距。尽管单抗是专一特异性，但一些肿瘤细胞无明确的特异性抗原标记，还由于肿瘤细胞的异质性，表面抗原出现跨系表达而影响对肿瘤类型的判断。故对于具体病例的诊断而言相当多情况下并不没有理想效果。又如MDS，受到单抗种类的限制以及其他不足因素，对MDS的定性诊断与分类可能是最不容易明确的。不同公司的仪器、试剂、质量控制等，都可以带给检测结果上的一些影响。

由于流式细胞提供的是events间接性信息，对一些信息的评判或界定不很明确，除了抗体的组合和标本因素外，一些细胞区域范围（包括表型特征）不明显，如单核细胞与幼粒细胞以及细胞碎片、血小板与有核红细胞（不易区分）；鉴定嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞尚不够准确。还需要流式细胞分析者排除碎片、细胞黏连及血小板黏附等出现的假阳性结果。

界定的R1、R2…细胞群，圈定细胞范围时有模糊，会造成某一细胞群比例偏高偏低。也反映出流式检查带有一些主观性。也容易漏掉极少部分的肿瘤细胞的分析，出现假阴性。

有核细胞增加与减少的相对性时有评判问题。如造血减低和血液稀释时的淋巴细胞比例增高与粒细胞减少症或缺乏症的中性粒细胞减少，常有混淆。

干扰因素太多，存在任一因素都可以影响结果评判。诸如标本有微小凝块，影响细胞量又会影响仪器运行；浆细胞最易于凝聚，加之处理影响，可以出现PCM诊断的假阴性；标本放置时间过长，影响有效细胞的数量。

流式图形分析显示粒细胞的成熟性和所含颗粒的多少，作为一个方法有它的特定含义和意义。但流式中重视的颗粒缺少的疾病谱偏宽，也不解释缺少的是嗜苯胺蓝颗粒还是中性颗粒。

常规计数≥5~10万个有核细胞，但与检测标本有核细胞中的目标细胞多少是无关的，故当骨髓稀释而异常细胞减少（如原始细胞、淋巴瘤细胞、骨髓瘤细胞）时，因目标细胞构成比例发生了变化而检出的细胞数常低于形态学检查。毫无疑问，目标细胞的减少会影响分析的定性与诊断。

鉴定血小板和巨核细胞普遍不重视，对CML、BCR-ABL1阴性MPN以及一些良性疾病的诊断明显不足。

临床信息不详且病种多，对临床不提示的或超出流式常规单抗套餐时，实际上常会出现漏诊或影响分析的定性与诊断等。

还有三个显著性问题：一是缺乏流式细胞的参考区间；二是一部分肿瘤性原始细胞不表达CD34甚至HLA-DR等标记，MRD检测一些病人化疗后会出现抗原的变异和丢失；三是流式检查并非一种简单的技术活，尤其是多色补偿需要多年的知识积累。

在参考区间方面，包括细胞的数量和质量，都没有很好建立。除了微量残留病检测多有一个不严格的参考范围外，报告单中大多有检测的各类细胞百分比，在描述或解释中也有这些细胞比例的变化或异常。很明显既然有检测的数值就会有参考区间。也很明显的是缺了参考区间，除了免不了带有随意性解释因素外，还不能对血液稀释（骨髓稀释）的程度做出适当的评估。诸如报告的一部分细胞弱阳性，带有模糊性，部分阳性和阴性设定的范围也有欠缺。

二是原始细胞形态特征与免疫表型不一致。形态学根据形态学特征评判原始细胞，当原始细胞比例达到一定比例时，如>20%就可以归类为AML；而流式是间接性根据门内某一特定细胞群的比例和表达的抗原特性评判的。如流式检查的原始细胞CD34和HLA-DR阴性，除了APL和嗜碱性粒细胞白血病外，还见于急性髓细胞白血病伴成熟型；甚至流式检查的CD34、CD117阴性的一部分，还有急性粒单细胞白血病和急性单核细胞白血病等。这样，在流式分析中会造成混淆（图1）。

图1 形态学原始细胞与流式CD34免疫表型

a为细胞形态有颗粒原始细胞，流式免疫表型检查常为CD34阴性；b为细胞形态学为比较典型的无颗粒原始细胞，流式免疫表型检查在一些病例中也有不表达CD34的

三是流式检测和分析实际上是一个非常复杂的过程，涉及许多方面，如抗体的选择与合理设计、操作的技术与经验、结果的合理解释、形态学的结合与对照、临床特征的结合与不断更新的血液病诊断标准的掌握等，故专业上以“流式细胞术”称之。

三、免疫表型与形态学互补

在各相关学科技术中，形态学与流式免疫表型的互补关系是最为密切的一对（图2）。流式免疫表型检查的长处与不足，恰与形态学形成互补。细胞形态学以大类诊断或基本诊断见长，流式免疫表型检查重在检出异常细胞群的系列、克隆性、抗原表达的增强、减低或缺失或跨系性。

图2 细胞形态学与流式免疫表型互补必不可少

由于流式免疫表型检测迅速，几乎与细胞形态学同步，可为形态学提供非常有用的细胞表型信息（如疑难的不易分类的白血病和ALL的系列），同时形态学也为流式免疫表型分析带去细胞学的外观信息（如AML中较多类型的评判），互补后会得出更多、更可靠和更恰当的诊断信息，以满足临床。

从整体上说，没有（细胞）形态学，流式免疫表型检测的部分标本诊断无所适从；没有流式免疫表型，（细胞）形态学相当部分的诊断也不会提高，诸如胞质棉絮状和毛发样突起的肿瘤性中小型淋巴细胞与小B细胞型成熟B细胞肿瘤，中大型的胞质嗜碱性较丰富无颗粒和胞核较大染色质幼稚的肿瘤性中大型淋巴瘤细胞与大B细胞淋巴瘤的关系等，都是在细胞免疫学的认知上帮助了形态学的识别和可预见性。

四、诊断模式与管理

总之，流式检测的免疫表型还是属于血液肿瘤诊断的基本项目，与细胞形态学互补优势极其显著。同步联检的发展方向极其必要，需要合并为一个实验室或部门，并由互为洞悉的或既会流式检测又会阅片的医师或技师同步检查发出诊断报告。

迪安诊断从2014年起执行两者的互补诊断至今，取得了很好的诊断效果和临床满意度。实施这一诊断模式体现在以下几个方面。

第一，是将流式实验室与形态学实验室合并为一个科室，便于管理和协调。

第二，规定形态学工作者需要了解流式等检查技术的基础，熟悉常用单抗反应特性及常见疾病的免疫表型特征。流式检查者需要了解形态学及其相关的基础，也需要掌握血液病诊断标准，尤其是WHO在不断更新的造血和淋巴组织肿瘤诊断标准。除了每日因需进行交流外，科内定期进行案例分析与探讨。

第三，规定每一份流式标本都需要进行有核细胞计数。骨髓有核细胞计数的意义：①可以准确计数骨髓中有核细胞的数量，有效提高与单克隆荧光抗体及相应抗原结合的特异性和准确性；②可以提高单克隆抗体选择的准确性，避免盲目选择抗体。

第四，规定每一份标本都应制片3张，2张wright-Giemsa染色，1张备用，必要时做细胞化学染色。如显微镜下根据原始细胞比例和形态，可以提前预判是否为白血病等血液肿瘤及其系列，即可加做血液病相关抗体，有效提高工作效率。

第五，流式检测数据分析必须与同步的形态学镜检互补（如图3和图4），两者的结果又必须与临床特征相联系。如果发现两者中一个项目不符或诊断证据尚有欠缺时，必须查明原因（如加单抗验证或提供进一步的依据；还是形态学问题，如小原始粒细胞不注意误认为淋巴细胞）。最后经审核发出诊断报告。

当前，时有所见的事实（如图3和图4）警示我们：“整合互补”是不可缺少的。同时加强非肿瘤性血液疾病流式免疫表型异常与形态学的探讨，并建议建立健康人流式骨髓标本参考数据。

图3 一例形态学与流式免疫表型不一的AML

a~d为一例细胞化学MPO和SBB阳性而流式和免疫组化MPO等多种阴性AML，骨髓涂片，白血病性原幼细胞偏小，少量胞质位于一则，大多可见不易察觉的浅紫红色细颗粒（a），MPO（b）和SBB（c）均为阳性，骨髓切片免疫组化仅为CD33阳性（d），包括流式检测CD34、HLA-DR、CD117、MPO以及淋系（B、T）系列2次结果均为阴性，后续的细胞遗传学和30种白血病融合基因均为阴性