非小细胞肺癌EGFR突变的分子影像学在体检测

摘要

靶向药物表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂（epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitor, EGFR-TKI）改变了非小细胞肺癌的治疗格局，研究表明只有EGFR敏感突变人群能从中获益。EGFR突变检测的主流方法是针对EGFR的DNA序列进行分析，标本可以是手术或穿刺获取的肺癌组织、胸水肿瘤细胞、循环肿瘤细胞、外周血游离DNA，其最大的缺点是无法分析EGFR突变的异质性。针对EGFR在蛋白质水平进行突变检测分析的技术尚不成熟，但随着分子影像学的发展，基于正电子发射型计算机断层显像（positron emission computed tomography, PET）-计算机断层扫描（computed tomography, CT）的靶向EGFR分子探针的研发，使得在体检测肺癌组织的EGFR突变状态成为了可能，而且可以检测EGFR突变的异质性。本文综述了目前靶向EGFR突变的分子探针的研究结果及进展。

晚期非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）的治疗真正进入了分子分型时代，患者自身疾病的分子特征和治疗密切相关，并需要以此为依据来选择相应的分子靶向药物。基于驱动基因的靶向药物不断出现，尤其是表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂（epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitor, EGFR-TKI），EGFR突变NSCLC患者有了越来越多的选择。近十年来，EGFR-TKI的研发和广泛应用，明显提高了突变患者的总生存期（overall survival, OS）。但所有数据都表明只有EGFR敏感突变人群能从中获益，因此EGFR的突变状态成为临床使用此类药物的重要前提，其突变检测结果显得尤为重要。现有检测的主流方法是针对EGFR的DNA序列进行分析，标本可以是手术或穿刺获取的肺癌组织、胸水肿瘤细胞、循环肿瘤细胞、外周血游离DNA，其最大的缺点是无法分析EGFR突变的异质性，从而一定程度上影响了EGFR敏感突变肺癌患者使用EGFR-TKI的有效率[1]。但随着分子影像学的发展，基于正电子发射型计算机断层显像（positron emission computed tomography, PET）-计算机断层扫描（computed tomography, CT）的靶向EGFR分子探针的研发，使得在体检测肺癌组织的EGFR突变状态成为了可能，同时可以检测EGFR突变的异质性。本文综述了目前靶向EGFR突变的分子探针的研究结果及进展。

1 EGFR基因突变

EGFR属于酪氨酸激酶受体家族，由细胞外配体结合域、疏水跨膜结构域和细胞内酪氨酸激酶结构域3个部分组成，通过与天然配体结合形成二聚体，使胞内酪氨酸激酶磷酸化，启动下游信号转导通路来调节细胞凋亡、增殖、分化等。EGFR基因突变主要发生在编码细胞内酪氨酸激酶结构域的18-21外显子，最常见的突变为19外显子的缺失性突变和21外显子的L858R点突变。这些突变基因编码的EGFR突变蛋白可不依赖于配体的结合，直接导致胞内酪氨酸激酶自动磷酸化，启动下游信号转导通路[2]。

2 EGFR相关的靶向治疗

针对EGFR的分子靶向药物，按其性质主要分为两大类： 一类是单克隆抗体，直接阻断EGFR与配体结合，从而阻断下游信号转导通路，如西妥昔单抗、帕尼单抗、尼妥珠单抗，但临床研究[3,4]表明EGFR单克隆抗体在NSCLC的靶向治疗上疗效有限，其治疗效果和EGFR突变状态及表达水平有关。另一类是小分子酪氨酸激酶抑制剂EGFR-TKI，在细胞内酪氨酸激酶结构域上与ATP竞争性结合，抑制下游信号转导，如吉非替尼、厄洛替尼、阿法替尼、奥希替尼。对于EGFR敏感突变阳性的晚期肺癌患者，IPASS、NEJ0 02、WJ0G34 05、OPTIMAL、LUX-Lung3/LUXLung6、AURA3等[5-10]III期临床研究先后证实，相比传统化疗，EGFR-TKI明显的延长了该类患者的生存期，也改善了患者的生活质量，具有良好的安全性。与此同时，IPASS、CTONG0806等[5,10-12]临床研究显示EGFR野生型患者并不能从EGFR-TKI使用中获益，未降低该类患者的疾病进展或死亡风险，故不推荐使用。

由此可见，EGFR基因突变是一线EGFR-TKI治疗受益的先决条件，EGFR-TKI的使用需以EGFR基因突变检测为基础已达成全球共识[13-15]。

3 EGFR基因突变传统的检测现状

目前EGFR突变的检测方法以组织检查为金标准，现在临床最常用的为基于实时PCR的检测方法，优点是准确可靠、特异性高、检测周期相对缩短，缺点是检测结果受组织量多少和肿瘤时空异质性的影响。细胞学检测及外周血EGFR突变检测作为组织标本突变检测的补充，也已经有了良好的发展。而细胞学检测需要检测方法灵敏度较高、实验室条件严格和足够细胞标本，虽然特异性高，但检出率低。外周血EGFR突变的检测与组织EGFR突变检测有较高的符合率，特异性高，但其敏感性不够。二代测序虽然可以提高外周血检测的灵敏度，但存在检测周期长、费用昂贵等缺点，暂时无法广泛应用于临床。

4 EGFR相关分子探针示踪的PET-CT在体检测

无论是基于肺癌组织、细胞学、还是基于外周血的游离肿瘤DNA片段的EGFR突变检测，均存在或多或少的局限性，尤其是时空异质性的问题无法解决。故现在急需一种能够实时、在体检测EGFR表达水平或突变状态的方法，以指导EGFR-TKI临床治疗。分子显像技术可以在活体状态下，通过将参与基因、蛋白的表达、物质代谢等过程中重要化合物及分子进行放射性标记或荧光标记，利用PET-CT、PET-MR或者SPECT等影像学技术，直接将复杂的生物过程变成实时、动态的图像，实现组织、细胞和分子水平的定性和定量研究。而EGFR作为肺癌的特异性靶点，如若标记相应的靶向药物，与蛋白受体上胞外结构域或胞内特定结构域相结合，再利用PET显像仪器探测放射性物质形成相应的图像，从摄取放射性物质的高低就可以直观的反应出EGFR的表达水平或突变状态。目前已有多位学者进行了这类分子探针的研究，一种是标记EGFR的单克隆抗体如cetuximab、Panitumumab，另一种是标记小分子EGFR-TKI如吉非替尼、厄洛替尼、阿法替尼，未上市的PD153035等。

4.1 单克隆抗体类分子探针

单克隆抗体直接靶向EGFR细胞外结构域，阻断EGFR与配体结合，从而阻断下游信号转导通路。单克隆抗体均为大分子，渗透进组织较慢，故标记时需要半衰期相对较长的核素，如64Cu、111In、89Zr。

4.1.1 西妥昔单抗（cetuximab） 西妥昔单抗是第一个经食品药品监督管理局（Food and Drug Administration, FDA）批准上市的EGFR单克隆抗体。Perk等[16]首次利用89Zr构建了靶向EGFR胞外配体结合域的分子探针89Zr-cetuximab，并在细胞A431移植瘤模型中发现EGFR高表达的肿瘤组织摄取明显高于非肿瘤组织。随后多位学者[17,18]用不同核素标记cetuximab，并用合成的分子探针在相应的荷瘤鼠上进行了显像研究，均表明EGFR高表达水平区域的放射性浓聚高于周围组织。但Niu等[19]合成了64Cu-DOTA-cetuximab进行显像后，未发现上述规律，反而原本摄取应该低的UMSCC-22B（EGFR表达水平低）细胞有较高的摄取，考虑为血管密度和血管通透性的影响，有待进一步证实。

4.1.2 帕尼单抗（Panitumumab） Nayak等[20,21]则标记合成了86Y-CHX-A’’-DTPA-Panitumumab和89Zr-Panitumumab，进行不同EGFR表达水平移植瘤模型研究，得到的结果也是EFGR表达高的区域存在放射性浓聚，摄取明显高于EGFR表达低的区域。

上述两种单克隆抗体类EGFR分子探针的相关研究充分说明其在体检测EGFR蛋白表达水平的可行性，但存在很多问题，首先该类探针作为大分子蛋白在核素标记过程中易发生变性或降解，还可能与正常组织发生交叉免疫反应，所以导致该类研究局限于细胞和动物研究，限制了其在临床方面的应用。再者就是EGFR基因突变主要发生在胞内酪氨酸激酶结构域，所以此类探针不能检测EGFR是否存在突变。

4.2 EGFR-TKI类分子探针

EGFR-TKI进行放射性标记后，可以与突变蛋白的胞内酪氨酸酶结构域特异性结合，而与未发生突变的蛋白结合相对较少，从摄取的高低就可以直观地反映出EGFR表达水平和突变状态，理论上明显优于单克隆抗体类分子探针。此类小分子物质探针渗入细胞快，所用标记核素半衰期较短，如11C、18F。

4.2.1 PD153035 PD153035是一种未上市的强效第一代EGFR-TKI，也是最先被研究的小分子酪氨酸酶抑制剂，对EGFR酪氨酸激酶的半抑制浓度（half maximal inhibitory concentration, IC50）为29 pmol/L，可在其6位或7位C上标记11C后生成11C-PD153035，不改变其化学结构和生化性质。

Dai[22]研究了11C-PD153035在三种肺癌细胞HCC827、A549、PC9中的摄取，发现有敏感突变的细胞株HCC827摄取高于其他细胞株，此体外细胞研究证实了11C-PD153035检测EGFR蛋白表达水平及EGFR突变的可能性；而Wang等[23]通过3种不同EGFR蛋白表达水平的肺癌移植瘤模型，从动物层面进一步证实了11C-PD153035的摄取与肿瘤细胞的EGFR蛋白表达水平成正相关；而Liu等[24]在正常人体内进行了相关研究，发现11C-PD153035在体内以肝和肾代谢为主，放射性核素的辐射剂量处在安全范围，这显然为临床推广应用奠定了生理基础；国内学者Meng等[25]进一步进行了21例NSCLC患者的临床研究，认为其摄取状态和EGFR表达水平成正相关，并且EGFR表达水平和患者的无进展生存期（progression-free survival, PFS）、总生存期（overall survival, OS）密切相关，从而表明11C-PD153035分子显像可以作为临床疗效的预测手段，指导临床靶向药物的使用。

11C-PD153035细胞、动物、临床三个方面的研究表明了此类小分子EGFR-TKI探针成像和临床推广的可能性，但研究多侧重于检测EGFR蛋白的表达水平，同时有研究发现PD153035对某些细胞系如A431有一定的毒性。因此，研究者们开始考虑标记其类似物如吉非替尼、厄洛替尼、阿法替尼等进行研究。

4.2.2 吉非替尼 吉非替尼（gefitinib）是ATP竞争性的EGFR酪氨酸激酶可逆型抑制剂，阻断细胞信号的传递，抑制细胞异常增生和转移，2003年FDA批准用于临床。从结构上看，吉非替尼既可以做11C标记，也可以用18F标记而不改变其生化性质。

Zhang等[26]和张锦明等[27]用11C标记合成了11C-gefitinib，从细胞及动物两个层面进行了相关研究，前者研究发现高EGFR表达水平的A431细胞株的放射性摄取明显高于低EGFR表达水平的Jurkat细胞，并在荷NFSa肿瘤的裸鼠模型上显示肿瘤区有11C-gefitinib特异性地浓聚，后者则进一步证实11C-gefitinib为特异性摄取，通过建立A549荷瘤裸鼠模型，发现有11C-gefitinib放射性浓聚的肿瘤区经gefitinib标准品阻断后，放射性摄取明显下降。

而Su等[28]用18F标记合成了18F-gefitinib，研究却得到了不同的结果，合成的18F-gefitinib在4种不同肿瘤细胞（低表达EGFR U87，高表达EGFR U87-EGFR，含L858R突变H3255，含L858R突变合并T790M突变H1975）中均未发现肿瘤区有放射性物质的特异性浓聚。考虑可能是由于其亲脂性高，与靶点可逆结合，从而肿瘤区积累过慢或排除过快所致。

11C-gefitinib显像研究发现其均能与突变型EGFR和野生型EGFR结合，故可以检测EGFR蛋白表达水平，但在检测EGFR突变方面无明显优势。而18F-gefitinib不能显像，与11C-gefitinib的研究结果不一致，具体原因尚不清楚。

4.2.3 厄洛替尼 厄洛替尼（erlotinib）也是一种经FDA认证的喹唑啉类衍生物，与EGFR的活性构象可逆结合，能高效且特异性的抑制EGFR酪氨酸激酶。它对突变的EGFR酪氨酸激酶的IC50达到了2 nmol/L。从结构上看，11C标记6-氧-去甲基erlotinib最佳。Memon等[29]首次利用11C合成了11C-erlotinib，建立HCC827细胞（外显子19缺失突变）和A549、NCI358细胞（EGFR野生型）三种荷瘤裸鼠模型，PET扫描和生物分布实验结果显示，11C-erlotinib在HCC827肿瘤模型中摄取最高，持续时间最长，在肿瘤组织区浓聚，而周围组织无或轻度摄取，而A549和NCI358 裸鼠模型则无放射性浓聚，提示11C-erlotinib可用于检测EGFR突变状态，筛选EGFR突变人群。该结果被Abourbeh[30]的研究再一次证实。而Petrulli[31]的研究则进一步支持11C-erlotinib能和突变的EGFR结合显像，该实验通过对PC9（EGFR野生型）、HCC827（19外显子缺失）、U87（胶质瘤细胞）、U87-EGFR（表达EGFR的胶质瘤细胞），SW620（肠癌细胞）5种荷瘤裸鼠模型进行PET显像，并进行未标记的厄洛替尼阻断竞争实验，发现原本高摄取的肿瘤区在被阻断后并不显影。

在上述细胞及动物实验的基础上，研究者们将眼光直接投向了临床应用。尤其是Weber等[32]直接对1例NSCLC脑转移患者进行11C-erlotinib显像研究，发现脑转移灶有明显的放射性浓聚，和周围脑实质对比清晰，不仅证实了11C-erlotinib能对原发肿瘤显像，还可以在脑转移灶中显像。Memon[33]对13例NSCLC患者厄洛替尼治疗前后行11C-erlotinib PET/CT和18F-FDG PET/CT扫描，证实11C-erlotinib PET/CT可以检测出18F-FDG PET/CT未检出的淋巴结转移灶，更加巩固了11C-erlotinib显像的优势。

为了进一步证实11C-erlotinib与EGFR突变蛋白是特异性结合而显像，Bahce等[34,35]进行了两项研究，第一项通过对已知EGFR突变状态的10例NSCLC患者（5例19外显子缺失突变，5例没有突变）中进行11C-erlotinib的显像研究，结果表明EGFR突变患者肿瘤11C-erlotinib的分布容积明显高于非突变组，证实了11C-erlotinib与EGFR突变蛋白的结合；后一项实验则是对已知EGFR突变状态的10例NSCLC患者行厄洛替尼治疗前后的11C-erlotinib PET/CT扫描研究，结果显示服用厄洛替尼有效的患者对11C-erlotinib的摄取明显减少，进一步说明EGFR突变与11C-erlotinib结合的特异性，可以通过其放射性摄取高低预测厄洛替尼的疗效，以及通过其放射性摄取的变化监测临床靶向药物的疗效。

11C-erlotinib的研究不管是从细胞、动物还是临床方面均证实其对EGFR突变蛋白显像有一定的特异性，不仅可以筛选突变人群，指导靶向治疗，还能作为疗效监测的一种手段。上述三种靶向药物均为EGFR酪氨酸激酶的可逆抑制剂，虽然在检测EGFR蛋白表达水平或突变上有一定的作用，但仍存在许多的不足，如与EGFR受体为可逆性结合，加上机体代谢的影响，导致放射性核素的注射量无法确定，同时不能对存在原发性T790M突变的NSCLC进行显像。

4.2.4 阿法替尼 阿法替尼（afatinib）是不可逆型EGFR酪氨酸激酶抑制剂，也是竞争性结合EGFR酸氨酸激酶胞内区的ATP结合位点，与可逆型抑制剂不同的是，其在结构上融合了可以与EGFR酪氨酸激酶结合口袋开口处附近所特有的氨基酸残基（Cys797）发生烷基化作用或共价键结合的基团，使其共价结合EGFR酪氨酸激酶而不离去，从而对EGFR酪氨酸激酶产生不可逆地抑制，而且对EGFR的T790M突变也具有良好的抑制能力。从结构上看，其不仅能采用11C进行标记，还可采用18F进行标记。但其是泛EGFR家族的抑制剂，还可作用于HER-2、HER-4，这个多靶点特性理论上可能会限制其作为分子探针的应用。

Slobbe等[36]直接合成了18F-afatinib和11C-erlotinib进行对比研究，共建立了A549（EGFR野生型）、H1975（L858R/T790M突变）、HCC827（19外显子缺失突变）3种荷瘤裸鼠模型，PET成像结果显示，11C-erlotinib显像剂在HCC827细胞荷瘤鼠中显示出肿瘤区放射性浓聚高于周围组织，而在无突变的A549、L858R突变合并T790M突变的移植瘤中均不显影，而18F-afatinib在3种细胞株的移植瘤中均显示滞留良好，这与阿法替尼对EGFR突变型和野生型NS CLC细胞均起作用相符（对21外显子L858R突变的EGFR IC50为0.4 nmol/L，L858R/T790M突变的IC50为10 nmol/L，野生型的IC50仅为0.5 nmol/L）。由此可见第二代TKI阿法替尼作为分子探针检测EGFR蛋白突变并不理想。

5 结语

细胞、动物实验及临床研究都已经证实了靶向EGFR蛋白分子探针在体成像的可能性，尤其是EGFR-TKI类分子探针。但由于对野生型EGFR或多或少具有结合能力，造成肿瘤组织与周围组织的靶/本比不够高，再就是亲脂性高，组织清除率快，不利于肿瘤组织内蓄积显像等缺点。而且所用标记核素如11C标记半衰期过短，不适合临床的广泛应用。因此出于临床转化应用的考虑，理论上较好的EGFR-TKI分子探针应该能用半衰期较长的核素标记（如18F），而且容易合成，同时兼具灵敏性高、特异性强、成像结果判定明确等特点。随着EGFR-TKI的不断研发，第三代产品如奥希替尼（AZD9291）作用机理明确，对EGFR突变蛋白的亲和力和特异性明显提高，对野生型EGFR作用极弱，可形成更高的靶/本比（40倍），故而值得探索将其标记成分子探针，研究其作为PET-CT示踪剂在体检测EGFR突变蛋白的可行性，以及通过其显像结果指导临床使用EGFR-TKI治疗NSCLC的可行性。

尽管理论上EGFR-TKI-PET不能区分EGFR突变的具体亚型，但应该能更好地预测EGFR-TKI的临床疗效。当然，从基础研究到临床使用还有很长的路，但是以靶向EGFR突变蛋白的分子探针为基础的分子影像为临床检测EGFR突变提供了一种全新的在体无创检测手段，为NSCLC的分子诊断提供了一个新的研究方向。

[罗丹静, 马进安.中南大学湘雅二医院肿瘤中心, 张锦明,中国人民解放军总医院核医学科. 等. 非小细胞肺癌EGFR突变的分子影像学在体检测. 中国肺癌杂志, 2017, 20(6): 415-420.]