CRISPR ：So easy 名记者的CRISPR初体验Science(用起来非常简单傻瓜都能用自己合成gRNA向导只要5美金这种凝胶电泳是根据分子质量将DNA分成不同的条带)

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(用起来非常简单傻瓜都能用自己合成gRNA向导只要5美金这种凝胶电泳是根据分子质量将DNA分成不同的条带)​

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生物学家Roland Wagner（左）指导Jon Cohen进行构建CRISPR系统。

是不是真的连傻瓜都能使用CRISPR这一基因编辑工具呢？

我对生物学相关知识有一定了解，但当我查阅新基因编辑技术CRISPR相关知识的时候，我却有些望而却步，该技术看起来非常复杂！但一位研究人员告诉我，CRISPR（全称clustered regularly interspaced short palindromic repeats）只是听起来吓人，用起来非常简单，傻瓜都能用。我自认为还是比傻瓜聪明得多，便打算验证一下这句话的真假。

于是，我就愉快地开始了我的CRISPR初体验。

相关资料显示，CRISPR在遏制或敲除基因上效果最佳，因此我打算试用CRISPR来敲除基因（如果想看视频，请参见bit.ly/vid-6312）。我设定了一个宏大的目标：用CRISPR敲除一个免疫基因，我猜想，敲除该基因，可以减少Zika病毒所造成的伤害。一旦成功，这将大大推动Zika病毒相关研究！（我的假设是，如果某个个体曾感染过登革热，并有该病毒的抗体，那么CD32可能有助于驱动Zika病毒的自我复制。）

Roland Wagner是加州圣地亚哥Sanford Burnham Prebys医学发现研究所Sumit Chanda实验室的博士后，他同意担任我的CRISPR指导员。Wagner来自奥地利，是一个经验丰富的攀岩爱好者，喜欢有条不紊地完成工作。他查找分析了CD32基因的序列，CD32具有五个不同的蛋白质编码区。如果我们切割其中一个蛋白编码区的DNA，该基因最可能被敲除——它将不再表达CD32蛋白。

CRISPR使用向导RNA将分子剪刀——CRISPR的一部分，Cas9——导向到基因组中的精确位点。我们可以买到向导RNA（gRNA），但Wagner并不打算这么干。他指出，他不确定gRNA的价格是多少，但假设购买gRNA要花500美元，他们自己合成，就只要5美金。

gRNA序列能与我们想要切割的CD32基因上的一段长度为20个核苷酸的序列互补。但是，基因组中的其它地方也可能存在与这段短序列一样长的片段，并会导致分子剪刀切割错误的位点。这种“脱靶”效应会严重地影响实验结果，消除脱靶效应是研究CRISPR的关键目标。为了使CRISPR更具特异性，在靶向的20个核苷酸外，Cas9还需要一段额外的序列：N-G-G，其中“N”可以是任何核苷酸。当Cas9在20个目标核苷酸后发现N-G-G时，立刻结合并打开DNA双螺旋，随后gRNA与目标序列相结合。最后Cas9切割DNA的两条链。

为了自制gRNA，Wagner把我们鉴定的CD32序列粘贴到免费数据库Optimized CRISPR Design中，查找紧挨着N-G-G的、符合我们要求的20个核苷酸序列。CD32中有41个可选片段。数据库扫描整个人类基因组，检查是否其它地方也存在相同的序列——潜在的脱靶位点。我们选择了一个仅存在于CD32中的序列。然后Wagner打开另一个网站，订购该段DNA序列。

DNA序列到货了，我第一次尝试了使用移液枪。自从我30多年前毕业以来，我就没有在实验室工作过。那时，我学会了一种可能是由Louis Pasteur发明的移液技术：我把一根手指放在我的嘴里，然后把一种化学品吸到一个薄的玻璃管里，吸足了量后，就用指尖捂住玻璃管。

现在，在Wager的实验室工作台上，我拿着一个看起来像喷枪的花式塑料小玩意，但是只要按一下，就能移取精确体积的微量液体。我的任务是将DNA序列从一个小试管移到另一个小试管中。第二个试管含有质粒——一种起到特洛伊木马作用的环形DNA片段。这个质粒是CRISPR实验定制的，里面已经包含了Cas9基因。它还含有60个核苷酸的“发夹”序列，这些序列最终将和那20个核苷酸链接在一起，形成完整的gRNA。

我用神奇的移液器把寡核苷酸转移到了质粒管里，添加缓冲液、水和酶。如果一切顺利，酶将切开质粒，切除一段DNA，并用gRNA替代这一段序列。但悲剧的是，实验进展不顺利。

当我移取酶的时候，Wagner指出，我的操作失误了！我在把吸头浸入液体之前，就按了吸取液体的按钮。

终于完成了一系列操作。在等待化学反应发生后，我们将CRISPR质粒带到电泳仪——一个有电线的托盘上。我们开始配胶，然后把CRISPR质粒滴加到不同泳道里。然后开始施加电压，这种凝胶电泳是根据分子质量将DNA分成不同的条带。用酶切出的小片DNA会形成明显的条带。

我的凝胶电泳只有一条带，来自质粒的条带。

“看来我们是失败了，” Wagner轻轻地说。“可能是你吸取酶的时候没吸到。”他说，刚开始做实验的时候，都会出各种差错。“这种时候，我会想回家。会有一种特别挫败的感觉。毕竟科学家的生活总是容易充满挫折的。”

我已经知道，不是任何傻瓜都能做CRISPR：至少，你得掌握基本的实验室技能。

Wagner与我同时进行实验，他的质粒正确地整合了gRNA和Cas9。然后，我们把质粒导入来自胚胎肾的细胞株中。几天后，我们从细胞中分离出DNA，用聚合酶链反应进行扩增，并使用电泳验证CD32基因已被切成片段。感谢上帝，我们终于成功敲除了CD32基因！！

“你做得很好，”Wagner安慰我说， “走吧！”

但说实话，我做得不好。但是CRISPR确实很好，很简单。

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