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PI和7-AAD染色死细胞检测 PI和7-AAD可用来染色死细胞，标准的细胞表面染色分析中用来排除死细胞。该染料不能通过完好的细胞膜，但可通过已破坏的细胞膜进入胞内。PI进入死细胞后，嵌入双链DNA或双链RNA中，而7-AAD则优先嵌入双链DNA。因为该嵌合使非共价结合，所以重悬细胞用的缓冲液中必须含有该染料，以保证死细胞被染色。 1. 染色细胞的表面抗原之后，用流式细胞染色缓冲液（货号#00-4222）洗涤细胞1-2次。 2. 在适量的流式细胞染色缓冲液中重悬细胞。 3. 每100µL细胞中加入5µL PI（货号# 00-6990）或7-AAD（货号# 00-6993）染色液。 4. 在冰上或室温下孵育5-15分钟。切勿洗涤细胞。 注：在实验过程中，缓冲液内必须含有PI或7-AAD。加入PI或7-AAD 后切勿洗涤细胞。 5. 使用流式细胞仪分析样本。 注：应在孵育后4小时内进行分析，因为细胞长期保留在 PI 或 7-AAD 之中，会造成细胞死亡。在2-8°C下避光存放，直到分析。 钙黄绿素染料染色活细胞检测 钙黄绿素AM、钙黄绿素紫 450AM和钙黄绿素蓝AM可轻易穿透细胞膜，选择性标记活细胞，适用于流式细胞分析或荧光显微分析；而细胞膜破坏的死细胞不能保留钙黄绿素。如要精准分辨出死活细胞群，建议同时使用Annexin V或7-AAD染色。 1. 准备单细胞悬液。 2. 在流式细胞染色缓冲液（0.1–1 mL）中重悬细胞，浓度为1-5x10e6细胞/mL。 3. 加入建议浓度的钙黄绿素染料并混匀。（参见产品说明） 注：根据实验情况，可以使用流式细胞染色缓冲液（货号# 00-4222）或PBS制备稀释的工作液。 注：钙黄绿素AM （货号#65-0853）/钙黄绿素紫450 AM（货号#65-0854）/钙黄绿素蓝AM（货号#65-0855） 4. 室温下孵育30分钟，注意避光。 5. 加入2mL流式细胞染色缓冲液，并在室温、400–600 x g下离心5分钟，弃上清。 6. 重复第5步。 7. [可选]染色细胞的表面蛋白。详细说明参见“流式细胞术中的蛋白染色”。 8. 使用流式细胞仪分析样本。 CyTRAK® Orange和DRAQ5®染色活细胞检测 CyTRAK® Orange（货号#65-0881）和DRAQ5®（货号#65-0880）是与双链DNA具有高度亲和力的蒽醌染料。可以穿透细胞膜，因此用来标记活细胞、死细胞或固定后细胞中的DNA。该染料在流式细胞术中用于区分有核与无核细胞。荧光显微镜下，它们用于识别细胞核的位置。 1. 制备单细胞悬液。 2. [可选]染色细胞的表面蛋白。详细说明参见“流式细胞术中的蛋白染色”。 3. 用细胞培养基或其他缓冲液洗涤细胞，然后用培养基或其他缓冲液，将细胞重悬为1x10e7细胞/mL。 注：避免使用含叠氮化钠的缓冲液。 4. 向细胞中加入CyTRAK Orange或DRAQ5, 使其终浓度达到2-10µM。并在室温或37℃下孵育10-30分钟。注意避光。 注：最佳浓度和标记条件应该进一步优化，以获得最佳检测性能。 5. 加入2mL流式细胞染色缓冲液，室温下400–600xg离心5分钟，弃上清。 6. 在适量的流式细胞染色缓冲液（货号#00-4222）中重悬细胞。 7. 使用流式细胞仪分析样本。 FVD染色死细胞 FVD细胞活性染料（FVD）能对细胞膜破坏的细胞进行染色，通过共价键与细胞内的蛋白交联，不可逆地结合到所有物种的死细胞内。 1. 在12 x 75 mm流式管中准备细胞。 2. 在不含叠氮化物和血清/蛋白质的PBS中洗涤细胞2次。 3. 在不含叠氮化物和蛋白质的PBS中重悬细胞至1–10x10e6/mL。 注：为了保持细胞染色的一致性，不建议对体积不足0.5mL的样本进行染色。 4. 向每毫升细胞中加入1µL FVD并立即涡旋。 5. 在2-8°C下孵育30分钟，避光。 6. 用流式细胞染色缓冲液（货号#00-4222）或同类溶液洗涤细胞1-2次。 7. 按需继续实验。 注：以上操作流程为在不含叠氮化物和蛋白质的PBS中染色，如果实在含有叠氮化物和蛋白质的PBS中染色，请联系我们（电话：010-57438396）获取具体操作步骤。 图1. 活性染料FVD eFluor® 520检测结果 用ConA刺激小鼠脾细胞4天。上图：根据前向和侧向散设门圈出全部细胞用于分析CD4和CD8指标。下图：根据FVD eFluor® 520对活细胞设门，然后进行CD4和CD8分析，可以明显看到排除死细胞干扰后数据更准确。 Annexin V染色死细胞 Annexins是与磷脂酰丝氨酸（PS）结合力很高的钙依赖磷脂结合蛋白。PS在正常生理条件下主要位于细胞质膜的内面。细胞凋亡开始后，PS在磷脂双分子层上的不对称分布被破坏，转移至细胞膜的外面，因此形成细胞自我吞噬作用。PS一旦位于细胞膜的外表面，就会被荧光标记的Annexin V结合上。 1. 将1体积10X反应缓冲液与9体积蒸馏水混合，制备1X结合缓冲液。 2. 收集细胞。 3. 用1X PBS洗涤细胞一次，然后用1X结合缓冲液洗涤一次。 4. 用1X结合缓冲液重悬细胞至1-5x 10e6细胞/mL。 5. 向100uL单细胞悬液中加入5µL荧光染料结合的Annexin V（货号# 88-8103/88-8007/88-8006/ 88-8005/88-8102/88-8008）。 6. 室温下孵育10-15分钟，注意避光。 7. 加入2mL 1X结合缓冲液，并在室温400–600xg下离心5分钟，弃上清。 8. 在200µL 1X结合缓冲液中重悬细胞。 9. 加入5µL PI或7-AAD活性染料，然后在冰上或室温下孵育5-15分钟。 注: 在数据采集过程中，缓冲液内必须存在碘化丙啶或7-AAD。加入PI或7-AAD后切勿洗涤细胞。 10. 使用流式细胞仪分析样本。 注: 细胞应该在孵育后4小时内进行分析，因为细胞长期保留在PI或7-AAD之中，会对细胞存活度造成影响。在2-8°C下避光存放，直到用于分析。 图2. Annexin V PE细胞凋亡检测结果 将小鼠胸腺细胞制成单细胞悬液，并在37°C下过夜孵育，然后检测凋亡细胞群。收集细胞并用Annexin V PE细胞凋亡检测试剂盒染色 （货号#88-8102）。 图3. Annexin V凋亡细胞检测结果 Annexin V+ PI-的细胞群中含有凋亡早期的细胞，未经过处理（左图）或经过10¬M喜树碱处理4小时（右图）的Jurkat细胞使用Annexin V细胞凋亡检测试剂盒染色。 DNA标记和活性染料 |
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