引物设计不求人！手把手教你设计RT-qPCR引物！

RT-qPCR 全称 Real-time polymerase chain reaction, 即实时聚合酶链锁反应，是一种在DNA扩增反应中，以萤光染色剂检测每次聚合酶链锁反应（PCR）循环后产物总量的方法。

OK～这里对RT-qPCR的原理，应用及数据分析就不再赘述了，因为今天我们主要讲的是如何设计出好的PCR引物。

相信科研小伙伴们都已经用过Pubmed来设计引物了，基本就是 “傻瓜式操作”就解决了！但这里还需提醒小伙伴们两点：
1. 需跨越至少一个外显子连接（一般我们用来做RT的RNA都是通过Trizol抽提法分离出来的，为了避免基因组的DNA也有可能被扩增出来，就要至少跨越至少一个exon-exon junction了）。
2. 不要忘记选对“物种”！（这里以人种示例）

但是Pubmed设计出来的引物一般不尽如人意，比如说引物之间存在极大的互补性，3’端的互补重叠，形成引物二聚体等等。因为用Pubmed设计引物本身能设置的参数条件就很少，所以它才是最简单的。所以，今天我要给大家介绍两款实用的软件，Primer Premier 6.0 和 Oligo 7.0。

今天主要讲讲第一款，至于第二款，改天再聊啦！

当然，这两款软件，要想用全功能版本，都是需要付费的哦！不过...，我们伟大的祖国有强大的某宝，这里就不多说了哈。

好了，我们进入今天的正题……（说了这么多废话，终于要进入正题了！！！）

首先，我们选一个基因举例来说，PPARA，至于为什么会选这个基因呢？因为啊，PPAR目前是肿瘤学研究中的一个“明星基因”，它的全称是Peroxisome proliferator-activated receptor, 即过氧化物酶体增殖物激活型受体，目前发现有三种亚型，PPAR a，PPARbeta/delta，PPAR r。

好吧…….听着好复杂的样子啊！总之，管它到底是什么呢，下面来说说它的引物如何设计。

首先，Pubmed检索目的基因，查找序列号。

这里，我们以Human PPARA为例，点开。

鼠标按着不动一直向下划，找到基金编码号。

点开前一个基因序列号，找到CDS序列。（因为这才是目的基因的编码序列！）

鼠标按下CDS，Pubmed会自动Mark出你想要的编码序列。然后....., copy下来就好了！

OK～到了这步，Primer 6.0这个软件就要发挥它的用武之地了！

打开已安装好的Primer 6.0这个软件（这里叙述的是全功能版本的哦！），点击File-New-Sequence，然后会跳出来一个框框。

粘贴Pubmed里copy好的序列，点击add。

找到菜单栏里的Analyze，Primer Search 或者直接鼠标右键单击Nucleotide sequence 也会跳出来Primer search 这个对话框。

好了，下面我们就可以来设置引物参数了！ 

点击 Primer Parameters，设置引物的退火温度（当50%的引物和互补序列表现为双链DNA分子时的温度。它足够低可以保证引物同目的序列有效退火；但同时还要足够高，以减少非特异性结合。一般低于引物的Tm值5度左右）

小编我一般设定引物的Tm值（引物的熔解温度）为50-70C，引物长度为18-30 bp。对于QPCR来说，一般设置产物扩增片段长度为70-200 bp较为合适。

上图中，大家有没有看到最下面那个框框，是可替换的引物对数，这个软件的好处是会自动对其所设计的引物进行排序，按分值从高到低排序，一般软件会默认可替换对数为5对。

OK～都设置完了，点击search就大功告成了！

界面上会显示出一个排序最高的引物，点击All Primers，你就会看到所有的六对引物了。当然～如果你想要更多，可在前面的可替换引物对数栏里变更你想要的引物对数哦！

OK～我们今天的引物设计讲解这里就完毕了，不知各位小伙伴们有没有get到这项新技能呢！
（细心的小伙伴不知有没有观察到一个有趣的问题哈～刚开始我们说到Pubmed的时候，有提到一个小tip，为了避免基因组DNA也有可能被扩增出来，我们设计引物时需要至少一个外显子连接。那用Primer Premier 6.0 这个软件又如何来解决这个问题呢？）
且听下回分解…………