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SNP引物和探针的原理在于探针退火温度： SNP的引物探针还是比较讲究的，首先探针的Tm值要比引物高5℃左右，保证引物延伸的时候探针正在模板上卧轨，等待被水解。 SNP检测尽量用MGB探针，由于MGB这种淬灭集团会结合到DNA的小沟，提高Tm值，也就是说普通探针要二三十个碱基才能达到的Tm值，MGB探针十多个就可以达到了。 比如MGB探针如果15个碱基就能达到对应的Tm值，普通探针需要25个，那探针中单个碱基的变化，在MGB探针中就是1/15的温度差，而普通探针则是1/25。MGB探针对于SNP检测的敏感度就更高了…… 举个栗子，探针设计时候温度都是65℃，探针C能完全匹配，那么65℃的时候，探针还有一半结合在模板上。而探针A不能完全匹配到模板，Tm值就变成了65℃-1/15×65℃=60.67℃，也就是说当65℃延伸的时候，A探针就已经不能结合到模板上了，就是这样来分型的。 设计的话，SNP位点需要尽量设计在探针的中间位置，尽量不要靠近3’末端。那怎么设计这样探针呢？ 有个简单的网站，直接输入SNP位点的序列，当然SNP位点需要用其他字母来替代，记得么？R=A/G，Y=C/T，M=A/C，K=G/T，S=C/G，W= A/T，H= A/C/T，B= C/G/T，V=A/C/G， D=A/G/T,N=A/C/G/T。 选择一下qPCR仪： 当然会自动识别楚SNP位点： 选一下荧光，由于MGB是ABI的专利，所以这里用的是一个叫BHQ plus的淬灭集团，其实效果基本一样。 最后，就获得探针和引物的组合了。 到时候合成的时候，把BHQ plus改成MGB去合成就行了。虽然有专利限制，但其实很多公司都是可以合成MGB的。到时候结果就会是这样的： 用Taqman检测SNP的话，其实就是相对每个位点测一次序便宜些。缺点就是一次只能测一个位点，当然这些方法主要都是检验科在使用啦，真有钱的大金主，不会在意测多少序列的应该……好了，今天就先策到这里吧…… |
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