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在qPCR实验过程中，合理的实验设计，探针及引物的高质量合成是其成功的关键。qPCR目前依然是核酸荧光定量检测的常规实验，然而获得信号特异、低背景的qPCR结果也非易事。从qPCR小白到大神，学习和摸索是少不了的。但是，君子生非异也，善假于物也，IDT PrimeTime®️系列产品，便是助您qPCR快速进阶的可“假”之“物”。 荧光 / 淬灭基团怎么选？ 荧光探针是qPCR实验的核心，确定实验目的后，首当其冲的是确定探针的类型，尤其是荧光基团和淬灭基团。 图1则是来源于IDT并在科研界广为流传的荧光基团选择表：根据qPCR仪支持的荧光通道选择合适荧光基团。  图1. 常见qPCR仪适配的荧光基团。 此处友情提醒，请尽量选择无需校正（Calibration）的荧光基团，以减少多余的“工作量”。图1所列荧光基团发射波长由短至长（520 nm ~ 668 nm）依次排列，当选择多个荧光基团时，尽量选择间隔远的可减弱荧光串色现象，提高检测灵敏度。 PrimeTime®️ qPCR系列探针涵盖了常见荧光-淬灭组合，可根据图2直接进行选择。请注意图2中对荧光、淬灭基团专利方面的相关备注，除了特殊备注外，大部分从IDT订购荧光-淬灭组合均免专利许可费。  图2. IDT常见荧光淬灭基团组 读到这里，有些qPCR中级选手有了疑问：为什么没有我经常使用的淬灭基团BHQ1（Black Hole Quencher®️-1）和BHQ2（Black Hole Quencher®️-2）？ 主要原因在于上述两种淬灭基团属于某公司专利，其他公司若要进行商用，需支付相应的专利费用（IDT也可提供BHQ系列淬灭基团探针）。而与之相比，IDT自行开发的IBFQ（Iowa Black®️ FQ）和IBRQ（Iowa Black®️ RQ）淬灭基团，其表现与BHQ系列类似，且无需任何专利费用。  图3. 不同荧光基团的发射波长及淬灭基团的选择 各级qPCR选手又有了疑问：图2中的ZENTM和TAOTM又是“何方神圣”？ ZENTM和TAOTM 指在探针第9、10碱基之间添加的第二淬灭基团。荧光基团ZENTM-IBFQ / TAOTM-IBRQ组合而成双淬灭探针，可实现优于BHQ的淬灭效果，而价格上比BHQ单淬灭基团更低[1]。 当使用FAM荧光基团与不同淬灭基团：ZENTM-IBFQ、BHQ1、Eclipse®️、IBFQ和TAMRA组合的5’核酸酶探针进行qPCR实验，背景和信号的荧光强度对比见图4。双淬灭探针以更低的背景和更高的荧光信号脱颖而出。  图4. FAM搭配不同淬灭基团背景与信号对比图。在ABI 7900HT Real-Time PCR仪器上，对0.5 ng cDNA利用5种qPCR探针对ACTB基因进行检测。 IDT提供的双淬灭探针作为5’核酸酶探针中的佼佼者，已成为越来越多高灵敏度检测中的不二选择。2017年9月Chao Shan等人发表在Nature Communication杂志的《针对3’UTR区域缺失的寨卡病毒基因组的单剂量减毒活疫苗可防止寨卡病毒的妊娠传播和引起的睾丸损伤》研究中，在小鼠模型上使用IDT双淬灭探针（ZENTM -IBFQ）进行病毒载量的检测，检测下限可低至100拷贝/mL（图5）[2]。  图5. 利用qRT-PCR 在不同免疫后时间点对病毒基因组的定量检测。虚线代表检测下限。（IDT双淬灭探针FAM-/ZEN/-IBFQ） IDT双淬灭探针“加强不加价”，因此无论从功能还是成本上，我们都推荐大家使用双淬灭探针。
关于双淬灭探针更多的信息及应用实例，可参考《两道“消防线”，守住你的qPCR”》。 想要检测更灵敏，如何用好LNA？ PrimeTime®️ 探针中还可以通过增加锁核苷酸（LNA, Locked nucleic acid）来增加探针的Tm值，得到“短小精悍”的PrimeTime®️ LNA探针。 LNA相对结合亲和力较强，一般来讲LNA:LNA > LNA:DNA > DNA:DNA。LNA碱基的位置与序列有关，match和mismatch的∆Tm一般＞15℃。因此，较短的PrimeTime®️ LNA探针拥有更好的淬灭效果，信噪比较低，提高了识别SNP的能力，常被应用于一些难检测的SNP和AT-rich区域的探针设计。 在设计方面我们建议如下：
2017年札幌东生物医学研究所的Yusuke Ono等人在研究中，为了克服癌症早期因cfDNA含量有限且KRAS突变频率较低造成的早诊瓶颈，在ddPCR平台引入预扩增步骤，并利用PrimeTime®️ LNA探针，在减少背景噪音的同时大幅度提高检测KRAS突变的灵敏度（图6）[4]，使得cfDNA KRAS突变的检测下限低至0.01%。  图6. 使用ddPCR检测突变KRAS探针的灵敏度和特异性。模板为携带已知KRAS突变的cfDNA，使用含有PrimeTime LNA探针，将突变和野生比例分别以10%，1%，0.1%，0.01%混合，证明该方法的检测下限为0.01%。 如何省时省力做设计？ 最简单的当然是“拿来主义”，使用IDT的预设计！ IDT提供的PrimeTime®️ qPCR 预设计检测包（Predesigned assay）包含一对引物和qPCR探针。这些预设计涵盖了人、小鼠、大鼠的大部分基因，既从碱基组成、长度等方面优化探针，还利用生信方法评估涉及的SNP位点（基于NCBI RefSeq数据库），可有效避免非靶区域扩增、剪切变异体和探针内部二级结构。 值得一提的是，IDT对于常见信号通路的基因位点均提供预设计（图7）。IDT承诺所有预设计扩增效率达到90-110%，R2>0.99，若无法达到，则不收费。 图7. 常见信号通路基因位点表 若预设计库中没有您想挑选的“对象”，还可利用IDT在线工具PrimerQuest®️ tool，针对任意种属的任意序列进行在线设计。关于设计的诸多Assay如何进行选择，IDT在Tm、GC含量，检测目标位置和扩增子长度等IDT已有详细的经验总结供大家参考。 表1. qPCR设计要点  好马还要配好鞍，Master Mix 哪家强？ 有了引物和探针，最后不能忘了反应环境！ PrimeTime®️ Gene Expression Master Mix 是IDT专利设计的2×预混型高效qPCR试剂，搭配Assay即可进行qPCR实验，可保证扩增效率高于90%。该混合液也适用于多重反应，在标准和快速循环条件下均表现良好。另外，Master Mix不仅可以搭配PrimeTime®️系列探针，也完全兼容市面其他品牌的Probe-based qPCR实验。同样，在应用于商业或诊断时无需任何专利费用。  图8. PrimeTime Gene Expression Master Mix 在标准和快速PCR循环条件下Cq值一致性较高。该反应配套使用PrimeTime qPCR Assays, PrimeTime Gene Expression Master Mix, reference dye，和cDNA梯度稀释模板（0.016–50 ng）, 每个浓度的cDNA在不同反应条件下Cq值差异＜1。 Master Mix除包含有Hot-start Taq DNA 聚合酶、dNTP、MgCl2外（附送单独包装的参考染料），还含有特殊的增强剂和稳定剂。因而其稳定性堪称Mix中的“Master Shifu”，即使经历长达7天50℃放置，仍具有高扩增效率且Cq值稳定（图9）。 即使周五实验完成后忘记放回冰箱，下周照样使用。  图9. PrimeTime Gene Expression Master Mix 在50°C 长达7天获得的一致性结果。该反应配套使用 PrimeTime qPCR Predesigned Assay (ID: Hs.PT.58v.45621572)，50℃条件下分别选择1，3，5和7天时间点进行检测。 以上就是PrimeTime®️ 装备一览，IDT官网提供的OligoAnalyzer Tool，PrimerQuestTool等在线工具更将使您qPCR进阶之路如虎添翼。更多信息，欢迎参考《想要在qPCR领域拥有一席之地，你需要这套装备》。 OligoAnalyzer Tool https://www./calc/analyzer Predesigned qPCR Assay https://www./site/order/qpcr/predesignedassay PrimerQuest Tool https://www./Primerquest/Home/Index PrimeTime®️ Multiplex Dye Selection Tool https://www./site/order/qpcr/primetimeprobes/multiplex |
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