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我叫骨头，是新来的NPC，最近要自己来设计qPCR引物了，听林师兄说得好简单的，就自己随便设计设计就行了。呃，可是我打开了AlleleID 6.0之后，还是有点懵。 呃，这边好像有好多种qPCR引物，我到底要选哪种呢？看上去都好神奇呢…… 杀姐姐：呃，其实这些都是qPCR引物。 我们可以将qPCR的引物和探针，分成三类： 第一类是染料法引物 主要是SYBR Green为代表的非饱和染料，和LC Green为代表的饱和型染料。这类染料，你可以理解为和EB发荧光的原理差不多。就是插入双链后，就能发出荧光。 第二类是水解型的探针 主要就是Taqman的探针或者Taqman-MGB的探针。主要就是利用聚合酶的5’-3’外切酶活性，把挡在扩增道路上的探针水解掉，水解后荧光基团就和淬灭基团分离开了，这样就能产生荧光，大概就是这样的： MGB呢，是一种淬灭基团，但是可以提高探针的退火温度，缩短探针的长度，不过成本会贵一倍多。而且是有专利的一般的引物合成公司是不能合成的。不过普遍来说Taqman探针都要比染料法qPCR成本要高。 第三类是杂交型的探针 这类探针包括了Beacon（分子信标），FRET（能量共振转移），其实芯片也算是杂交型的探针，但这里我们就暂时不讲芯片了。Beacon是茎环结构的探针，在杂交后，探针的茎部打开，结合到产物上，打开后的荧光基团会和淬灭基团分开，产生荧光。由于Beacon的探针部分退火温度发生变化就不会产生荧光，所以一般会用来检测DNA的突变，但探针超难设计，所以用的人也不多。 FRET也是一种杂交探针，这个挺复杂，用的是能量的转移，这需要两个探针来完成，前部的探针的3’末端结合一个荧光基团，后部探针的5’末端结合另一个荧光基团，第一个荧光基团的发射光就是第二个荧光基团的激发光，也就是你点了亮第一个荧光基团的话，第二个荧光基团就会亮，这样产物越多第二种荧光的两都就越大。这种方法可以定性并定量，但是成本比较高，所以一般用的人不多。 第四类就是其他 类似这个MLPA，这是利用连接酶形成不同长度片段，通过毛细管电泳进行检测的一种技术，也很少会有人用这个。 好了，骨头，我们实验室穷，你还是用最简单的SYBR Green吧。 qPCR引物探针的种类真的是很多，不要以为只有Taqman和SYBR Green呢！其实这些方法的主要思路也都是让产物的量和荧光成正比，这就是qPCR进行定量的精髓。呃，至于这个引物设计软件么，就回复“qPCR”就有了（记得分清大小写）。
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