肺癌专题 | 异质性的Notch信号通路促进小细胞肺癌进程

文章题目：Intratumoural heterogeneity generated by Notchsignalling promotes small-cell lung cancer

研究人员：多家机构联盟研究（eg. Stanford University School of Medicine，OncoMed Pharmaceuticals）

发表时间：2017/05

期刊名称：Nature

影响因子：40.137

研究背景

Notch信号通路的活性在决定细胞命运（包括增殖、分化以及凋亡）过程中发挥着重要作用。以往的研究发现，在不同情况下它可抑癌也可致癌。在肺的发展过程中，Notch信号通路激活能够抑制前体细胞分化为神经内分泌细胞。在小细胞肺癌中，NOTCH基因功能缺失和Notch异位激活可产生抑癌效果。在小鼠小细胞肺癌模型和人类肿瘤中，Notch信号通路内源性激活将会导致10-50%的肿瘤细胞由神经内分泌向非神经内分泌转变。这个转变机制部分由转录抑制因子Rest（也叫Nrsf）进行调控，Rest可以抑制神经内分泌基因的表达。非内分泌Notch激活的非小细胞肺癌生长缓慢，起到一定的抑癌效果，但是这些肿瘤细胞出现化疗耐药并向神经内分泌的肿瘤细胞提供营养供给，在一定程度上又起到了促进肿瘤发生发展的作用。临床前的模型试验表明，Notch阻断结合化疗能够有效抑制肿瘤生长和延迟复发。综上，基于小细胞肺癌通过激活一部分肿瘤细胞的Notch信号通路来营造自己的微环境，临床上可以利用这部分细胞作为一个biomarker来筛选一些适合做Notch阻断联合化疗治疗的肺癌病人。

研究方法

研究样本：SCLC基因敲出小鼠模型和肿瘤患者

研究手段：细胞培养，免疫荧光染色，基因表达量分析

研究内容: 小细胞肺癌中Notch信号通路抑癌和致癌双重作用机制的阐释

分析

1）SCLC两种不同类型的细胞

方法：免疫荧光染色 Hes1（Notch信号通路产物）

样品：p53；Rb；p130三个基因敲出的SCLC小鼠模型（n=18mice），

SCLC能检测出Hes1 LUSC患者。（n=172 sections）

内容：

1、SCLC敲出小鼠和患者免疫荧光染色图片和可检出Hes1的细胞比例（见Fig.1a-d）

2、流式细胞仪计数18个小鼠GFP high细胞的百分比情况。（见Fig.1e）

3、采用qRT-PCR技术，检测Notch通路上的基因在GFP high和GFP neg细胞中的表达量情况。（见Fig.1f）

4、流式细胞仪计数小鼠在经过DMSO和DBZ(γ -secretase inhibitor dibenzazepine)处理之后，GFP high细胞的百分比情况。（见Fig.1g）

5、免疫印记技术展示存在Dll4配体或72小时之后移除Dll4，GFP high细胞系表达的情况（见 Fig.1h）

6、GFP and Uchl1免疫荧光展示。（见Fig.1i）

7、GFPneg and GFPhigh 肿瘤细胞生长差异，一个是漂浮成簇，一个是附着生长。（见Fig.1j）

8、GFPneg and GFPhigh细胞生长和繁殖情况。（见Fig.1k）

结果：

1、GFP neg细胞表达配体基因的水平高于GFP high细胞（见Fig.1f）

2、没有Dll4配体的GFP high细胞GFP，Hes1表达量降低。说明有一部分细胞可以激活内源Notch信号通路。

3、在小鼠模型中，GFP high细胞比GFP neg细胞内分泌神经gene的表达量更少。（见Fig.1i）

4、内源性的Notch激活和Notch异位Notch激活都有抑癌效果。

Fig.1小细胞肺癌包括生长缓慢，Notch激活非内分泌肿瘤细胞

2）Notch通路激活促使SCLC 神经内分泌细胞向非神经内分泌细胞转变

结果：

1. 不同类型细胞中受体、配体和靶基因的表达水平展示。所有的非神经内分泌 Hes1 positive表达的细胞至少有一个Notch受体gene表达，所有的神经内分泌 Hes1 neg表达的细胞至少有一个Notch配体基因表达。然而也有一部分非神经内分泌 Hes1 neg表达的细胞也至少表达一个受体gene，可能是受到Notch配体的影响，进行了应答。（见Fig.2a）

2. 流式细胞仪计数显示，GFP neg 表达的肿瘤细胞与Dll4配体有着高度的亲和力，从而促进GFP的表达（对照组是用磷酸盐缓冲盐水）。（见Fig.2bc）

3. GFP high细胞表达GFP依赖于外源性的配体Dll4，在Fig2e中，与非神经内分泌细胞混合培养能够促进细胞表达GFP，相反经过DBZ处理，表达下降。

   

Fig2. Notch信号通路的激活促进了神经内分泌细胞向非神经内分泌细胞转变

3）一个关键的Notch的靶，揭示解释转化成非神经内分泌细胞的机制

结果：

1、基因富集分析筛选在GFP high细胞中前十个可以抑制基因表达的转录因子。例如，Rest能够降低神经内分泌细胞的基因表达水平。在4个小鼠模型中，利用qRT-PCR技术分析发现它在GFP阳性细胞中高表达，在GFP阴性细胞中低表达，可以抑制非神经内分泌细胞向神经内分泌细胞转化。（见Fig.3a,b）

2. Rest是N1ICD的直接靶向产物, Rest和Notch存在相互作用。（见Fig.3c,d）。

3. Rest被敲除后，减少了N1ICD使非神经内分泌向神经内分泌细胞转化的作用。（见Fig.3e）。

4. 在Rest高表达的神经内分泌细胞中，神经内分泌基因表达量下降，并且转化成为非神经内分泌细胞。（见Fig.3g）

Fig.3 Notch信号通路靶向产物Rest能够抑制小细胞肺癌神经内分泌细胞的分化

4）Notch活跃的SCLC细胞可以促进神经内分泌细胞生长，化疗和Notch阻断剂联合可以抑制SCLC生长

GFP high细胞和GFP neg细胞分别像星形细胞和神经元细胞的样子。星形细胞能够为神经细胞提供养分。也就是说非神经内分泌细胞可能是肿瘤派生出来的微环境，通过为神经内分泌细胞提供养分从而促进小细胞癌生长。

结果：

1、三种条件细胞培养显示，不区分GFP high和neg的混合培养方式肿瘤细胞的生存效果更好。（见Fig.4a）

2、神经内分泌细胞和非神经内分泌 GFP high细胞混合培养能够促进神经内分泌细胞系生长。（见Fig.4 b-e）

3、GFP neg细胞，用EP方案后凋亡的细胞数目比GFP high细胞高，说明神经内分泌细胞对EP方案更敏感。（见Fig.4 f）

4、在TKO SCLC同种异体移植模型和PDX模型中，作者用Notch阻断剂，来阻断神经内分泌细胞向非神经内分泌细胞的转化，在克服化疗耐药的同时，也抑制了NE细胞的生长。

结论：

用化疗和Notch阻断剂联合可以抑制SCLC生长，且效果比单用好。

Fig.4 Notch信号通路激活的小细胞肺癌细胞能够促进神经内分泌小细胞肺癌细胞生长，化疗和阻断Notch信号通路相结合能够抑制小细胞肺癌生长

讨论

1. 在小细胞肺癌中，Notch信号通路既有抑制又有促进肿瘤的作用。本文为采用Notch阻断和化疗相结合的治疗方案提供了理论依据。适用此类治疗方法的患者可以通路Notch通路靶向产物作为biomarker进行筛选。

2. 此类治疗方案更适合早期小细胞患者或者是作为第二次治疗方案。

3. 小细胞肺癌中Notch信号通路抑癌和致癌双重身份机制的阐释，在研究新的治疗方案上有着重要的指导意义。

   
   

参考文献：

[1] Jing Shan Lim, Alvaro Ibaseta, et,al. Intratumoural heterogeneity generated by Notch signalling promotes small-cell lung cancer[J].Nature, 2017, 545：360–364.