果子导读这篇帖子本来应该是大年初一发的的，但是我给忘记了。今天补上。
看到豆子今天的帖子和感想，能有这样优秀的伙伴在身边是一种幸运。提蛋白只是一个简单的操作，但是豆子老师连讲了5期，这只是她技能的一个小点，还有一大批帖子等着我们，这一年，有高师姐和豆子老师在，我自己很期待。
本来还想讲几句，但是此刻心里翻江倒海，五味杂陈，不知道如何开口。医院前门的包子铺没有开，导致我几天没有吃早饭，后门没有什么餐馆开门，中午就像游魂一样找吃的，昨天开始消毒细胞培养箱，整个过程需要两天。
过年会给连续的工作带来打击，工作的停顿从放假前3天就开始，一直持续到放假后3天，加起来都要两周，而那种因为放假而停下来的热情，不知道要什么时候才能完全恢复，老家还有一句话，正月里面都是年。 以下是今天豆子老师的正文：
最近看了很多场的团拜会的表演，觉得好像有种说不出的感觉，但恍惚中星星点点仿佛照亮了什么，自己好像是舞蹈队的队长，一场下来有时候会表演四五个节目，自己好像爱好唱歌，音乐老师都说挺好的（可能只是鼓励，反正我把他当真了），自己能吹竖笛还是满分，鼓乐队的都特别想要我，但是还是被舞蹈队打败了，O(∩_∩)O~，自己仿佛朗诵的也不错，脱稿演讲也有那么多次，自己或许文章写的还可以，还上过报纸。。。 原来竟是勾起了自己尘封多年的记忆。我们有不同的自己，可以高山流水，阳春白雪，可以喜欢李煜潜来珠帘动，惊觉银屏梦，可以有长江东去浪淘尽的魄力，可以有润物细无声的温柔，有惟吾德馨的高雅，平平凡凡也是不错。不管做何种选择，自己一定是舒服的开心的就好，所以我看到很多人说好像自己忘记了很多东西，我觉得其实并不是忘记了，只是没有一个契机让自己想起来，你的记忆就放在那里等你去取，但是放在哪里却需要自己去找。 今天讲讲线粒体蛋白的提取线粒体的重要性我想大家肯定都知道，线粒体主要是提供细胞内各种物质代谢所需要的能量。能量是我们进行一切事情的前提条件，想要研究线粒体的功能以及物理化学性质，提取线粒体必不可少，线粒体大量存在于代谢旺盛的细胞中，如动物的心肌，脑，肝，肾等器官和组织的细胞中，今天也是照旧提到几种方法。 总的来说提取线粒体的过程大概是先破碎细胞保存线粒体的活性，再梯度离心分离线粒体，最后破碎线粒体，提取线粒体蛋白。 为保证获得完整的线粒体，务必做到：第一，全程低温操作；第二，快速；第三，在不破坏亚细胞器的情况下破碎细胞，这是制备线粒体的最关键环节。
 1.细胞(至少2 ×10^7个，最少一个10cm的dish，最好至少用两个)PBS洗3次。 2.收集细胞，先将细胞用PBS收集，再离心，弃掉PBS。 3.收集沉淀,用1ml 2mM HEPES匀浆，须在冰上操作，研磨30-40次。 4.4℃,800g离心10 min,收集上清于一新EP管中。 5.将上清以4℃, 11,000g离心15 min,将得到的沉淀用RIPA缓冲液洗涤并重悬,放于冰上15 min, 4 ℃, 10,000g离心10 min,收集上清即为线粒体蛋白
BSA的作用是为了去处内生的游离脂肪酸，甘露醇和蔗糖是为了建立一定的渗透压。
组织线粒体的提取(以脑组织为例)A液:甘露醇0.3mol/L，EDTA 0.1mmol/L，PH=7.4，使用前加无脂肪酸的BSA 1g/L 1.取新鲜脑组织，PBS冲洗，洗净血水，冰浴中剪碎，加入A液，匀浆，组织研磨20次。 2.将组织匀浆物转移到离心管，4℃，3000rpm离心10 min，弃去沉淀。 3.取上清，转移至新的离心管中，4℃，10,000rpm再次离心10 min，留取沉淀即为脑线粒体。
还有一种提取组织线粒体的方法，但是需要用低温超高速离心机，如果有的话可以可以选择。 组织线粒体提取2：A液：0.32mol/L蔗糖、10mmol/L EGTA、50mmol/L Tris-HCl,PH=7.4
B液：0.32mol/L 蔗糠、50mmol/L Tris-HCl,PH=7.4 取组织如前，加入A液匀浆，1000g离心10 min， 取上清液17,000g离心20 min，沉淀置于B液中， 在质量浓度为75g/L，120g/L 聚蔗糖组成的不同密度梯度上，以68,000g离心1 h，其沉淀物即为线粒体， 置于B液中存于-80℃。
试剂盒提取线粒体：（SM0020）组份： Lysis Buffer Mito-Wash Buffer Store Buffer
（与组织块相比，培养细胞特别是贴壁培养细胞在用玻璃匀浆器匀浆时较难破壁，因而要选用小容量玻璃匀浆器、间隙严密的研杵上下研磨培养细胞）。
2. 将组织或细胞匀浆物转移到离心管，4℃，1000g离心5 min。 3. 取上清，转移至新的离心管中，4℃，1000g再次离心5 min。 4. 取上清，转移至新的离心管中，4℃，12,000g离心10 min。离心后的上清含胞浆成分，可从中提取胞浆蛋白。将上清转移到新离心管，线粒体沉淀在管底。 5. 往线粒体沉淀中加入0.5 ml Wash Buffer重悬线粒体沉淀，4℃，1000g离心5 min。 6. 取上清，转移至新的离心管中，4℃，12,000g离心10 min。弃上清，高纯度的线粒体沉淀在管底。 7. 用50-100 ul Store Buffer 或合适的反应缓冲液重悬线粒体沉淀，立即使用或-80℃保存。
最好用Bradford法测定线粒体浓度，对比Bradford法（考马斯亮蓝)和BCA法，两者都有干扰物质，但相比之下Bradford法的干扰物质影响更小一点
以下为两种方法对DTT、EDTA、EGTA和蔗糖等的最大允许浓度
这是豆子的实验专栏，下周二再会。
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