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（圖多殺流量，慎入） 又是一年入學季，又有許多小白往生物這個大坑里面跳。記得本科入學的時候副系主任說：“二十一世紀是生物學的世紀。”然后他頓了1s，接著說：“我們都是被這句話騙進來的……” 全班黑線 (─.─||| 既然入坑了，就得努力掙扎。本文獻給剛入生物科研坑的新生，老司機請忽略。 ——進入正文—— PCR可以算得上是各生物實驗室的標配技術了。無論是基因定量、克隆、組裝、突變、測序……都離不開基于PCR的實驗。目前，PCR相關試劑、耗材及儀器已經發展得相當成熟，包括聚合酶以及緩沖液的優化，使得擴增能力、保真度和兼容性均得到極大的提高。因此我們不再需要像過去一樣，分散部分注意力用于摸索熱循環條件、調整反應體系各底物的濃度等。也就是說，整個PCR實驗條件，基本可以模板化，而不需每做一個實驗都從頭開始摸條件。 然而PCR實驗中，有一個環節是廠家無法幫我們優化的，那便是引物設計。本文第一部分將以人 EGFR 基因為例，手把手教各位用最簡單的方法，設計用于實時定量PCR研究基因表達水平的引物。在第二部分還會簡單介紹，如何用相同的在線工具來評價引物。 （注：本文僅介紹的引物設計方法，僅適用于染料法qPCR之于基因表達定量研究，不涉及其他應用。像ORF克隆，沒有特別的方法，就是老老實實在ORF一頭一尾設計一對，用DNAStar lasergene等軟件可以輔助設計，或者自己手動。而如果要做點突變、插入、刪除，或者多片段組裝，可以使用NEB相應的在線工具。） 第一部分：用Primer Blast設計引物。 首先，上NCBI搜人 EGFR 基因。 
往下拉，可以看到這個基因可能存在4種轉錄本。（NM開頭的就是mRNA，其他暫時別管） 
繼續往下拉，找到各個轉錄本的具體信息，可以看到isoform a~d共4個轉錄本。 
以isoform a為例，點擊NM_005228.3那個超鏈接，進入下面這個頁面。 
點擊右方的Pick Primers，進入引物設計的Primer Blast頁面。可以看到PCR Template那里已經幫你填好了。現在，其他地方暫時留空，把PCR product size的Max改成350。qPCR反應中，延伸時間一般不超過30 sec。按常規Taq酶的反應速度1 kb/min來計算，30 sec可以合成500 bp。但酶活性會隨著反應時間的延長而下降，所以保守起見，將最大產物長度設為350 bp甚至更低比較合適。太短也不行，否則跟引物二聚體分不開，所以下限70不用改。如果硬是得不到什么合適的引物，那就把這個數字往上調，最好別超過500，要不然qPCR的反應條件就得改了（其實也就改延伸時間）。 
接下來，Exon junction span選項改為Primer must span an exon-exon junction。這里的意思是，至少有一條引物跨過了外顯子之間的連接處。這樣就算有基因組DNA污染了cDNA，也不會被擴增出來，保證定量準確。當然如果有的基因硬是沒有內含子，改了這個選項就會報錯。 
接下來的選項不用更改。Specificity check默認打鉤，幫你跑引物特異性驗證。Organism已經幫你自動填了人類（9606是Homo sapien的編號，你想研究其他物種，那就在一開始搜基因的時候搜對應的物種）。最后一行，如果你把鉤打上的話，就會允許引物幫你擴增其他isoform（本例中就是isoform b~d）。當然，這不代表著會把所有isoform一起擴增，或者說強制一起擴增。如果需要這么做，我們需要返回前面更改一下設置。這一點第一部分的末尾注明。 
點擊Get Primers按鈕，就會幫你設計引物了。由于是在線工具，請耐心等待幾十秒。有時候人多，可能需要等幾分鐘。 
按照這個方法設計出來的引物，我做了那么多基因，成功率基本接近100%。這個在線工具的算法也在不斷優化，按照近兩三年的使用情況來看，沒有遇到過失敗的。（尤其是使用比較良心和穩定的試劑。在國內我是用天根，在美國是用原名biotool剛更名為bimake的試劑。好吧你說是軟文我也懶得反駁，反正我就用這兩家。這里也沒有欽定的意思，我也用過Qiagen，Biorad和Thermo的，也能做得很好，但貴。） 那如果要同時擴增isoform a~d全部4個轉錄本，那怎么辦呢？很簡單，由于不同轉錄本之間同源性很強，基本上只有5’或者3’端有點差異，因此我們只需要指定引物落在所有轉錄本的共同區間就行了。 回到剛開始的頁面，我們可以看到最短的是最下面的轉錄本。前面一共8個外顯子（就是綠色的小豎線）是所有轉錄本都完全一致的。最后一個外顯子從圖上判斷不清楚，但我們可以直接忽略。也就是說，我們只要讓反向引物落在第8個外顯子之前，就可以把所有4個轉錄本一起擴增出來了。  往下拉，這一例中我們可以隨便點擊任何一個轉錄本的NM那個超鏈接，比如還是isoform a，進入同樣的頁面。但這次在點擊Pick Primers之前，點擊Highlight Sequence Features。 
然后你就會看到頁面的底下變成了這個模樣。我們把高亮的序列設置為exon，并高亮第8個外顯子。目測一下，這個外顯子一直到1252位堿基。記下這個數字。
回到上方，點擊Pick Primers，并把反向引物的3’端邊界設為1252。注意，不是5’端邊界，否則就會強制反向引物一定要從1252之后開始。此例中，我們是要強制反向引物不超過1252。其他的選項，按照本文前面講述的方法進行調整。然后點擊Pick Primers按鈕。
此時傲嬌的程序就會跳出來抗議說，你這樣會P出其他的isoform。然而這就是我們要的結果。于是把所有的鉤都選上。
點擊Submit，再耐心等一會，就能得到能夠擴增所有isoform的引物了。
神馬？講了那么多，還要是手把手式的，如果你還要問我怎么擴增其中一兩個isoform而不是全部，那我勸你還是早點棄坑吧。[和善的眼神.jpg][微笑][再見] 順便思考一下，如果isoform之間是5’端有差異，那到時候應該選擇哪個轉錄本作為基準，參考哪個數字，改動哪個參數呢？我覺得，按照生物科研入坑者的平均智商都應該想得出來，這里就不解釋了。 第二部分：用Primer Blast評價引物 有時候我們并不需要親手設計引物，從文獻或者數據庫里面就可以找到。但在正式使用之前，我們可以利用Primer Blast來看看那些引物是否靠譜。 這里順帶介紹一下幾個常用的引物數據庫： RTPrimerDB： RTPrimerDB: the real-time PCR primer and probe database PrimerBank： PrimerBank qPrimerDepot： https:// primerdepot.nci.nih.gov / 具體如何使用就自己摸索了，都非常簡單。 現在同樣以人 EGFR 基因為例，我們從PrimerBank搜到一對引物。這時候，前面的方法還是一致的，但此時，把數據庫的引物序列輸入到Use my own forward/reverse primer那里就可以了。PCR product size那里可以不用改，保持默認。但請更改下方的Exon junction span的設置為同前文所述一般。
此時拉到最下面，點擊Get Primers，就會彈出結果頁面。然而，針對這一對引物，我們卻會發現如此結果，在Exon/Intron設置那里報錯了。由于我們僅僅要求引物必須跨過外顯子的連接處，這就代表，數據庫的這一對引物并沒有符合這一要求。
有時候我們會發現，程序認為引物可能存在非特異擴增。這時候先別慌。如紅框所示，如果非特異的引物-模板結合，在引物的3’端末尾最后兩個堿基，存在至少一個錯配的時候，非特異PCR反應就幾乎不可能進行。（Template的點代表完美互補配對，顯示的字母為錯配堿基）
我們甚至還能用Primer Blast來幫我們算一下，某一對引物到底能擴增出什么基因。具體怎么做，就自己研究了。（其實就是輸入已知引物，Template不填，其他保持默認……） 下課！
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