韩呈武：人芽囊原虫形态学的研究进展(2016) ◈实验技术

开心100mm05xkw 2019-04-17

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人芽囊原虫(Blastocystis hominis B.h.)是一种常见的人与动物肠道寄生虫。于1849年首次报告,1912年从人体粪便中发现,根据其形态特征归属于酵母菌,并命名为人体酵母菌,其后,在哺乳类、鸟类、爬虫类、两栖类及昆虫类都得到检出。B.h.一直被认为是一种对人体无害的酵母菌,1976年有学者进一步对形态特征进行了光镜与电镜区别。根据其性质、生理和形态体征发现,B.h.严格厌氧,采用培养细菌或真菌的培养基不能生长,营养类似原虫,室温培养3d死亡,pH 7环境生长,无细胞壁,具有伪足和原虫线粒体等特点。1996年以后进行分子生物学的研究,人体分离虫株间的遗传性显示了多形态特点。目前,确定B.h.分为9个遗传子类型,另在鸟类、哺乳类同样亦可检出,确定其为人畜共患病原菌。为提高B.h.检出率,本研究重点就B.h.形态学鉴定、方法与B.h.病进行综述。

1 流行病学与检出率

B.h.世界均有报告,高发于热带和亚热带地区。广西省地处亚热带,气候温暖潮湿,是多种寄生虫病流行的重要地区。近年研究表明,B.h.感染在广西人群中较常见。但是,临床医师对恶性肿瘤患者B.h.感染认识不足,易漏诊或误诊,导致恶性肿瘤患者的病情加重。

吉川尚男认为:由于检查方法不同(如直接镜检、染色检查、培养检查),检查对象和鉴定水平存在差异,各地区检出率差异性较大。美国为22.9%,英国为6.9%(96/1390),日本采用粪便碘染色镜检+直接涂片检查+姬姆萨染色检查阳性率为0.47%(30/6422)。其采用培养方法,提高阳性率为2.45%(50/2037),并强调反复多次检查慢性腹泻的患者粪便检出率高。张峰等介绍,我国有几十个省市报道有B.h.感染。

笔者注意到20世纪70~90年代一直以B.h.无致病性处理。在日常粪便常规寄生虫检查中,以铁苏木素染色,油镜观察,检出率为45.0%,曾强调腹泻患者更为多见,并指出一般镜检容易与白细胞混淆。

近年胡缨等对就诊的1185例慢性腹泻患者进行粪便检查,B.h.感染率为12.24%,其中有黏液脓血便患者感染率显著高于其他类型腹泻者(P<0.05);不同性别、年龄腹泻者间感染率差异无统计学意义(P>0.05);农民感染率最高(为20.29%)。实验室辅助检查中,69.66%的感染患者中有血红蛋白降低;80.69%的感染患者IgG、IgM、IgA均正常;86.90%的感染者CD3+、CD4+表达水平降低,CD8+表达水平相对稳定,CD4+/CD8+比值下降。结论认为,B.h.感染是慢性腹泻的1个重要病原体,其致病作用不容忽视。

全国人体重点寄生虫病现状调查SWOT分析(2015)认为 :寄生于人体且致病的肠道原虫常见有溶组织内阿米巴、蓝氏贾第鞭毛虫和B.h.等,上述寄生虫是引起人体腹泻、腹痛的主要病原体。目前,B.h.在全世界依然被列为威胁人类健康的10种主要寄生虫病之一,其感染潜在危害较大,且易与一般胃肠道感染相混淆,容易漏诊或误诊,严重时可危及生命。

2 生活史

长期以来,B.h.生活史尚不清楚,造成对其形态和致病性不明确。近期研究认为,B.h.通过3种方式进行发育与繁殖:颗粒型方式、空泡型方式、阿米巴型方式。见图1。如何使滋养体形成空泡型,颗粒型营二分裂繁殖及形成包囊型,至今不明。可从宿主粪便培养中看到,包囊型分化成空泡型与颗粒型。由于作为具有感染性质的包囊型在人体盲肠和大肠内形成与寄居,人工培养不能造成肠道微环境,故在培养基中看不到包囊型。包囊随着粪便排出外界后,经口食入感染,在人体肠腔内脱囊,才能形成空泡型与颗粒型B.h.,而后,其再进行分裂、繁殖和增生,完成生活史。因此,包囊型发育成为空泡型与颗粒型只有在宿主肠道内才可看到,体外人工培养不可能完成包囊型B.h.。

注:空泡型见于生活史的底部(通常在临床标本中可以看到);颗粒型的发育见于生活史图的左侧部分;阿米巴型见于生活史图的右侧部分。颗粒型与阿米巴型的虫体均可以由空泡型(中心体)产生而来;增殖可通过二分裂(空泡型和颗粒型)、出芽(形成阿米巴型)、裂体生殖(中心体)和孢子形成(空泡型,少见)而发生。

图1 B.h.生活史

3 形态学特征描述

吉川尚男报告,目前共识有3类型B.h.:空泡型、颗粒型和阿米巴型。空泡型与颗粒型的不同之处在于虫体中心部位有无液泡,空泡型虫体内所呈液泡为无构造和类似细胞液泡样的均匀物质,而颗粒型则可以看到虫体中心部位有颗粒样物质存在,此为区别两者依据。见图2、3。阿米巴型最显著特点为形态不规则,见图4。其有伪足和伪足运动,但运动相当缓慢,细胞核内含有空泡和颗粒。颗粒型虫体也能以二分裂方式繁殖。何妮等描述,空泡型直径3~64μm,大小差异悬殊,折光性强,虫体透明,活体时细胞核不可见,细胞内有1个极大空泡结构。1990年研究报告B.h.还存在包囊型,直径为2~5μm,囊壁厚。不同来源的宿主其包囊形态不同。

注:中央有巨大空泡,核紧靠边缘。

图2 空泡型虫体模式

注:细胞呈泡状结构,内含大量大小不一、功能不详的颗粒,核靠近边缘。

图3 颗粒型虫体模式

注:形态不规则,有伪足、核边缘化,中央有空泡和颗粒。

图4 阿米巴型虫体模式

4 显微镜不同倍率检查与形态特征

4.1 低倍镜检查

笔者采用生理盐水直接粪便涂片低倍显微镜观察,B.h.为无色或浅黄色,圆形或卵圆形,大小不一,数量多时视野可呈“满天星”点状。内含1个巨大透明体,其周围围绕以极小细胞质,在细胞质内可看到有少数折光小体(颗粒),遇到普通水或蒸馏水可以迅速破裂而消失,见图5(仅见虫图轮廓)。

图5 患者粪便标本低倍观察

4.2 高倍镜检查

在光镜下(40×10),生理盐水涂片中B.h.为圆形、卵圆形,无运动现象,核及其他结构不易辩认,不易与其他肠道原虫包囊区别;可见3类型:空泡型、颗粒型和阿米巴型。新鲜粪便标本立即涂片可观察到直径为5~50μm的空泡型和颗粒型虫体,见图6。此外,还可检出直径为3~5μm的包囊型虫体,通常小型虫体光镜观察比较困难。

注:培养的虫体在中央均有液泡(CV)。具有圆形小颗粒为颗粒型(GF);无颗粒者为空泡型(VF)。

图6 B.h.普通光镜(A)与相差显微镜(B)观察

排出粪便后,放置4h再进行粪便涂片时,空泡型与颗粒型虫体不能维持原来形态,此为B.h.严格厌氧性质决定。虫体排出后接触空气,会发生急剧变性和裂解,见图7。变性的空泡型与颗粒型虫体与原本不固定的阿米巴型虫体很难区分。从粪便标本中检出特殊的阿米巴型就比较困难。

注:在盖玻片周围的虫体,由于接触空气(氧气)导致虫体裂解,呈形态空化、溶解(A)。再延时后,可以完全变性,细胞膜呈纤维状,其中央呈颗粒聚焦现象(B),完全溶解。

图7 培养中虫体,呈变化的多态性

空泡型与颗粒型不同点在于依细胞中心位置的液泡,空泡型呈均匀无结构,颗粒型则具有细小颗粒物质。在高倍光镜下仅从中央液泡就可区分两者形态差异,但电镜观察并不显著。

4.3 油镜检查

B.h.低、高倍率显微镜颗粒型,不易与肠道内较小原虫、哈门内阿米巴、脆弱双核阿米巴等区别。用铁苏木素染色光镜(100×10)观察,B.h.形态多样,可见空泡型、颗粒型、阿米巴型及二分裂型。其中以空泡型多见,虫体显示出显著囊壁,中央有清楚和染色较深的区域将核推向虫体边缘,核染成深蓝色,多在3个以上。见图8、9。

图8 铁苏木素染色光镜(100×10)观察B.h.空泡型,核边缘化

图9 铁苏木素染色光镜(100×10)观察B.h.空泡型,核边缘化

4.4 瑞姬方法染色

空泡型虫体,形态多样化,中央空化,核边缘化。见图10。

图10 瑞姬方法染色空泡型虫体

4.5 电镜观察

何妮等介绍:B.h.电镜观察可根据包囊有无纤维外衣将其分为纤维包囊型和包囊型2种。纤维包囊型能吸附细菌和其他包囊,导致异体宿主感染。2种包囊型内部结构大体相同。B.h.浆内含有粗面和滑面内质网、高尔基体、溶酶体、糖原颗粒等,细胞核内有异染色体,线粒体差异变化大,细胞膜有微吞饮功能,细胞外可能包被纤维外衣。在培养中发现,B.h.包囊形成过程中蛋白代谢增强,细胞核周围及粗面内质网区域管沟样机构增加。

5 采用不同检查方法与形态特征

对B.h.而言,检查方法与检出率密切相关,不同的染色方法有不同形态特征,学者曾进行的不同尝试与经验,现分别介绍如下。

5.1 碘染色方法

此为鉴定粪便阿米巴包囊经常采用的方法,取一滴碘液在载物片上,用牙签采取粪便少许,涂成薄片,加盖盖玻片镜检,低倍镜可以看到B.h.呈耀眼亮点,高倍镜可看到B.h.当中的空泡,此可与其他包囊鉴别,见图11。如果虫体较少、粪便标本排出时间过长或标本保存不好就难以检出。

注:A为结肠阿米巴包囊(下面)和多态性B.h.的颗粒型虫体(上面)。B为可看到二分裂虫体的标本。无论哪一种虫体,都可以染成黄色,在细胞质周围可见颗粒状的线粒体样物质和细胞核(B.h.)特征

图11 患者粪便标本碘染色

5.2 Cone染色液方法

本方法优点为直接检查与固定标本同时进行。将粪便标本涂成薄片,在涂片标本处于半干状态,滴加染色液(见配方),染色30min,用蒸馏水轻轻冲洗,加盖片镜检。染色适宜度为酵母菌等浓染。B.h.呈深蓝色或黑色,此为染色液特异性的结果,见图12a。镜检发现染色不理想时,仍然可重新再染1次。如果想永久保存标本,可采取蒸馏水冲洗后干燥,或用乙醇梯度脱水,用二甲苯透明后,再用光学树脂封片。在此染色片中,油镜下可看到虫体周围有一圈空白区(此为B.h.周围1层纤维状结构不被染色而形成的空白区),这可与其他原虫进行鉴别 ,见图12b。

染色液配制: 90%乙醇170 mL;100%甲醇160 mL;醋酸20mL;石炭酸20 mL;1%磷钨酸12 mL。将上述试剂注入618mL的蒸馏水中,混合均匀,加入氯碳混合剂(武藤化学和光纯药工业产品)5g,混合后备用。

注:A为B.h.浓染时呈深蓝色甚至黑色,但看不到内部构造;B为浅染色时,可以看到中央的空泡和颗粒状的细胞质,在虫体周围呈1个轮廓的“空圈”,可为鉴别特征。

图12 患者粪便标本cone染色

5.3 MIF固定染色方法

适用于粪便中原虫及蠕虫虫卵的固定、染色和标本保存,原虫与虫卵标本可长期保存。但B.h.不期望长期保存,只是短时间尽可能将标本处理,仅存留一部分标本作为长期保存备以后使用。使用甲醛固定的标本不能保持其原来的圆形形态,空泡型与颗粒型会形成多种多样形态,见图13。

注:B.h.形态不固定,中央空泡染色不均匀,在周围细胞质内有线粒体样结构和核,此点为鉴定特征

图13 粪便标本MIF固定染色方法

5.4 培养方法

以下介绍的方法为简单且检出率高的方法,之后还可进行遗传学检查,特别适用于DNA测定,很有实用价值。虽然已经报道多种培养基方法,但以液体培养基更为简单方便。液体培养基组成:氯化钠8.5g;氯化钙0.33g;氯化钾0.3g;天门冬酰胺0.5g。

培养基制作:用1mol/L的NaOH调整蒸馏水pH 7.0~7.4,加至1 000mL。放置120℃,高压灭菌20min,灭菌后备用,放入冰箱可保存一年以上。加入无菌马血清,制作成液体培养基,放入冰箱可保存1个月以上。此外,可分装在5~15mL塑料管中灭菌后备用。培养基装入培养容器70%容量即可。

培养基放置冰箱冷藏,接种标本时,必须将培养基置于室温事先预热,将新鲜粪便培养放入培养基,用灭菌棒搅拌均匀。与放入粪便量有关,一般采用15mL的塑料管,放入1g粪便较适宜。如果采用微型管,一般在5~10mg(3倍火柴头大小)为宜。

放入37℃温箱培养,2~5d,每天以灭菌吸管,吸取管底沉淀物表面,放载物片,盖上盖玻片,在显微镜下进行观察。可见B.h.繁殖的虫体。见图14、15。由于粪便内细菌繁殖,培养管内产生压力,培养管可能发生自然脱落现象。当培养管盖脱落时,内容物可能喷出,污染温箱或环境。另外,培养虫体在2d急剧繁殖,消耗营养多,需要在次日转种1次新培养基,保持继代培养。培养基中渣滓较少时,进行DNA提取为宜。

注:可以看到呈圆形大小不等的虫体,也可观察到多形态的阿米巴型虫体

图14 培养繁殖的虫体(活体形态)

注:能清楚看到多核虫体,2个核的端极都以对角线形式存在,形成“双眼”状态

图15 培养的姬姆萨染色虫体

5.5 3种方法联合检查观察

该方法为阿米巴原虫经典染色方法 ,众多教科书的阿米巴原虫图谱大都依此法染色。1948~1963年,笔者在协和医院寄生虫室对粪便寄生虫常规的检查中,每例患者标本均采用粪便直接涂片、碘染色、硫酸锌漂浮法3种方法联合显微镜检查,凡遇到原虫且即便是可疑时,必须进行铁苏木素染色方法制作标本,经油镜检查与鉴定 ,共完成115834例寄生虫感染患者的检查与统计,并获得B.h.检出率45%的统计结果。可见所用检查方法决定检出率高低。

6 临床表现

B.h.是近20年来被人们所重视与腹泻相关的人体寄生虫,其症状无特殊表现,易与肠道一般感染相混淆。一旦粪便检出B.h.即可确诊。对于部分慢性腹泻而病因不明的患者应注意该虫感染的可能。脓血便原因分析可能是红细胞能为B.h.提供营养物质,故而B.h.感染更易存在于黏液脓血便中;再者慢性腹泻治疗不当易引起肠黏膜损伤和肠道功能紊乱,甚至出现黏液脓血便,上述情况下B.h.更容易侵入机体。

胡缨等报道,在对683例恶性肿瘤住院患者进行B.h.病原学检查中发现,受感染者112例(16.40%),其中黏液脓血便组感染率显著高于其他类型粪便组(P<0.05);不同性别、年龄间感染率差异无统计学意义(P>0.05);在不同治疗组中,化疗组感染率最高,为26.40%;在不同肿瘤类别组中,消化系统组的感染率最高,为28.51%;低清蛋白组感染率显著高于清蛋白健康组(P<0.05);免疫功能低下组感染率显著高于免疫功能健康组(P<0.05)。B.h.大量繁殖导致感染者不同程度的肠道病变,其临床表现无特异性;大部分感染者主要表现为腹痛、腹泻、腹胀、厌食、恶心、呕吐等症状;部分感染者可出现乏力、发热、全身不适等,易与一般炎性反应相混淆;个别重症患者可导致严重腹泻、低蛋白血症、全身水肿等,甚至危及生命。

7 治疗

治疗本病多采用甲硝唑(灭敌灵),每次口服250mg,每日3次,5~10d为1个疗程,可使粪便阴性。部分复发或治疗无效,可加大剂量为750 mg。对于不同的虫株,敏感性可能不同。对于耐药患者,可采用复方磺胺甲噁唑、痢特灵、双磺喹啉、黄连素或鸦胆子治疗。黄道超等认为,甲硝唑疗效好、不良反应小,廉价安全,使用方便,且具有抗厌氧菌作用,可被作为治疗人和动物阿米巴病的首选药物。