果子荐读
今天，我自告奋勇地和高师姐合写一篇帖子。
qPCR应该是每个团队都会做，最大的问题是，很少有人做标准曲线。
标准曲线又分为相对标准曲线和绝对标准曲线。
相对标准曲线
是用第一轮qPCR的产物作为模板(如果丰度高，也可以直接用cDNA)，只不过这个模板是倍比稀释的。
这是我之前做过的笔记：
上机反应：
最终会自动生成标准曲线，上面会告诉你这对引物的扩增效率，一般这种情况就可以了。如果是要制作绝对定量的标准曲线：
高师姐推文中方法是可以的，他用的是质粒作为模板。我这里给出在有条件的情况下更加标准的方案。
大家在看完高师姐的推文后再回过来看即可。
既然我们想要得到的是RNA的标准定量，那么标准品最好是RNA，而不是DNA，但是如果你要检测的是DNA的绝对定量，那么用质粒没有问题，最好是直接合成DNA的双链。
那么现在的问题是，如何得到目的基于的RNA，提取的总RNA里面有，但是无法分离。
这里可以用体外转录的方法获得，体外转录在以后的CRISPR/Cas9，RNA-pulldown里面都会用到。
用试剂盒可用，那么我们就获取了目的基于的RNA，这个RNA在此时就是标准品。这时候可以测浓度，梯度稀释。
然后再把梯度稀释的RNA， 各自逆转录为cDNA，再用cDNA作为模板，构建标准曲线。这样的标准曲线，可以计算出RNA的绝对量。
而我的一个师弟，使用RNAscope技术检测ER RNA水平的时候，就用的这个方法构建了标准曲线。
anyway。技术细节在一开始并不重要，重要的是，要有构建标准曲线的意识。
我们写帖子，并不是要以老师的心态去教人，我们是想给那些迷茫的朋友带来希望。如果在构建标准曲线方法，你也有心得，那么欢迎给我们投稿。
以下是高师姐今天的正文
今天是八月的第一天，建军节，在这祝所有的军人节日快乐。今天是我回西昌的第十天，终于感觉整个人有活回来的感觉。也不晓得是为什么，只要回到了西昌，我的睡眠量和质都会增加。每天可以睡到10个小时以上，隔音耳塞啊眼罩也不需要，肩颈腰也没有那么酸痛了。虽然每天也在干事情，什么分析数据啊，看文献啊，但是就感觉特别的放松，特别的自在。很有可能这个地方是我生活了十几年的地方，非常有安全感。也有可能因为我们家在一个小山村，夜晚非常安静，周围也没有什么灯红酒绿可以分散注意力，所以入睡比较容易。总之感觉这次回家休养了一次。整个感觉除了悲伤而外，其余的还不错。
家门后的小路在上周的分享以后，应大家的要求我们分享一期关于标准曲线的建立方法的小帖子。
绝对定量PCR的标准曲线
在这里再复习一遍绝对定量的含义
用已知浓度的标准品制作标准曲线来计算未知样品的量。
标准品的制备
1.含有目的基因的质粒
1.用与qRT-PCR扩增的那对引物，通过一般PCR扩增出目的片段。
2.纯化、胶回收后连接到质粒上，我通常用pcDNA3质粒上（果子：这一步被困的同学，看周二豆子老师的实验专栏，分子克隆很重要）。
3.转化、质粒扩增、提取、纯化和测定初始浓度。
pcDNA3要是你不想自己做分子克隆，可以交给公司做，大概1000元一个，一个月交货。自己做的，顺利的话就一周可以拿到。但是要注意，
公司交货的时候有可能质粒是溶解在TE buffer中的，所以需要跟公司交涉质粒一定要溶解在去酶的ddH2O中，切记切记。
2.纯化后的PCR片段
1.这个PCR片段一般需要比你的扩增片段长，且需要包含你的目的片段。因为在扩增时，你的母链在开始阶段会有错配。
2.PCR扩增出来后，需要用胶回收纯化此片段。
3.纯化完后，测定初始浓度备用。
一样需注意纯化产物不要溶解在TE buffer中。
3.基因组DNA或cDNA
需要用纯化柱提取DNA或cDNA，保证纯度。在不确定试剂盒最后的elusion buffer是否为去酶的ddH2O时，建议用自己配置的DEPC 水。
所有的标准品中我比较推荐质粒，因为它比较稳定，好保存，且比较稳定。如果你选用其它的标准品，请保证所有作为标准品的核酸都必须保证稳定。
4.核酸拷贝数的计算
分步推理计算核酸拷贝数
1.A260吸光度值=dsDNA 50ug/ml=ssDNA 33ug/ml=ssRNA 40ug/ml
2.计算核酸浓度
＝(OD260)×稀释倍数×(33 或 40 或 50)=ng/ul
3.1dolton 即表示 1g/mol
4.1 mol =6.02×10^23摩尔分子(拷贝数)
5.平均分子量(MW)：
ssRNA=碱基数×340 dolton/碱基
dsDNA=碱基数×660 dolton/碱基
ssDNA=碱基数×330 dolton/碱基
由此可以推断出：
拷贝数计算公式（copies/ml）=6.02×10^23拷贝数/摩尔×(浓度)/(MW g/mol)
也就是：(6.02×10^23)×(g/ml)/(DNA length×660)=copies/ml.
(6.02×10^23)×(ng/ul×10-9)/(DNA length×660)=copies/ul.
比如：
5000 碱基质粒，浓度 100 ng/ul
MW=5000bp×660dalton/bp=3.3×10^6daltons，即 1mol=3.3×10^6g
摩尔数 =(100ng×10^-9)g/3.3×10^6
copy 数＝摩尔数×6.02×10^23＝5×10^10copies/ul.
公式法
(6.02×10^23拷贝数/摩尔)×(浓度 g/ml)/(MW g/mol)=copies/ml
MW与上述一致
标准品的稀释
再次重复一下，一般一条标准曲线取至少5个点（我一般做8个），浓度范围要覆盖样品的浓度区间，保证定量的稳定性。如果你自己加样比较稳，建议至少做两个孔，如果不确定，可以多加几个孔。
一般采用倍比稀释法
倍比稀释.png实例
给大家分享一个我上上周刚做的以质粒制作的标曲
标准品的制定
1.我需要扩增的是RSV的NS1基因（因为文章尚未发表，所以就不提供具体信息），我首先让生工帮我制备了一个和我扩增的目的片段一致的质粒。
2.根据我的质粒浓度，我计算了我的质粒拷贝数，进行了倍比稀释
倍比稀释标准曲线的制备
标准品的扩增曲线
扩增曲线
标准品溶解曲线
溶解曲线
标准品的标准曲线图
标准曲线计算公式
Ct值
以Ct值为横坐标，拷贝数为纵坐标制作方程式
标曲方程式计算样本的拷贝数
若样本的Ct值为18.23，将Ct值代入线性方程式：
即y=-0.2297*18.23+12.095=7.9075
Quantuty=10^7.9075=80816492.21copies
双标准曲线法
1.每次实验都分别用标准品做内参基因和目的基因的标准曲线。
2.同时扩增各个样本中目的基因和内参基因 。
3.从各自标准曲线上计算待测样本中初始表达量 。
4.将目的基因表达量进行归一化处理以消除初始 RNA或 cDNA量的差异带来的表达差异。
计算标准曲线的方法如上。
用其他的标准品制作标准曲线方法类似质粒的方法，在这就不一一赘述了。
谢谢大家，下周四见。
百香果花
