免疫学常用方法之ELISA（酶联免疫吸附测定）

在前面的推文中我们了解了基于抗原抗体反应的两种常用方法免疫组化和免疫荧光，那么在此基础上，对抗原或者抗体进行酶标记，形成了新的能够定性或定量检测蛋白的ELISA（1971年由Engvall和Perlmann发明）分析方法，这个方法用的非常之多，小编不骗你哦，好好学。

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ELISA的原理总结一句话就是，将抗体或抗原结合到固相载体上，随后与某种酶连接形成酶标示的抗原或抗体，将受检测的抗原或抗体与其反应，最后加入酶反应的底物反应形成有色产物，根据其颜色深浅进行定性或者定量的分析。其中可提炼如下的关键词：抗原或抗体的固相化、酶标记抗原或抗体、颜色反应。通过这样的标注，就能够很好理解了吧~~~~

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ELISA的步骤主要有以下几大步：（使用较多的双抗体夹心法）

包被

将特异性抗体或抗原用包被用的稀释液体稀释之后，加入到ELISA用的96孔板（俗称白板）中，100 μL/孔，37℃放置4 h左右，随后弃孔中的液体；封闭液（一般为5%小牛血清）37℃封闭40-50 min左右，结束后用洗涤液洗三遍，每遍5 min左右，洗完倒置于吸水纸拍干。

抗原抗体反应
加受检测标本（稀释浓度根据具体来定）于上述白板中，至少两个重复孔，100 μL/孔，37℃反应1 h左右，随后用洗涤液洗三遍，每遍5 min左右。

酶促反应
一般根据试剂盒提供的参考值来设定酶标抗体的浓度，37℃反应1h左右，100μL/孔，随后用洗涤液洗三遍，每遍5min左右。加入酶底物，100 μL/孔，室温避光反应5 min，终止液（50 μL/孔）终止显色。

结果检测
酶标仪检测结果即可啦~~~~

是不是很简单，市面上有很多试剂盒供大家挑选，步骤也写的非常详细，在小笔看来主要还是把握原理比较重要，这样千变万变都不离其宗，很容易上手哒。当然很多实验就是看着简单操作起来可会有很多bug，主要需要注意的点有以下几个：

样本和试剂

ELISA可以检测血清、细胞分泌因子（以细胞培养上清液检测）、尿液及其他分泌物等。最常检测的还是血清样本，细胞分泌因子在小笔的实验室也检测的相对较多。对于血清，可按照常规采血方式采集，防止出现溶血（减少非特异性染色），一般置于-20℃保存即可。

对于试剂来说，在试剂盒中都有明确的保存条件，按照说明书里的要求来就行了啦~~~~每次使用后未用完的部分及时放回冰箱即可啦。

精确性
ELISA属于比较精细的实验，需要保证移液器的准确，操作的规范性，这对实验结果的可靠性影响很大；

洗涤彻底，封闭适宜
经常有小伙伴在做ELISA的时候会出现实验结果重复性不好、背景高，很大程度上是因为洗涤的不彻底或者封闭不充分造成的。如果出现这样的情况，可通过增加洗涤次数或者延长洗涤时间、亦或者是可提高封闭液浓度或延长封闭时间来改善。

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最后小笔想说，千说万说不如自己去做、去摸索，在困难中摸爬滚打，好过别人苦口婆心，我自己是比较喜欢个人去总结一些经验来着，因为我倔，呵呵，一般不撞南墙不回头，自己试过才知道，恩恩，你们不要学我，有时候看看攻略或者别人的意见，可以少走很多弯路的~~~~小笔真心的！！！by the way，fighting！