2015-07-24 10:32 来源：丁香园论坛菌体为超声法裂解，裂解溶液中含 50mM Tris-HCl, pH 8.0， 100mM NaCl， 5mM EDTA， 0.1% NaN3， 0.5% Triton-X100， 在使用前加入 0.1mM PMSF 每250毫升裂解液中加入约50克菌体，工作15s，间隔15秒，超声破碎45分钟，超声后加入10mM MgSO4 和0.1mg/ml 的溶菌酶和Dnase 0.01mg/ml，室温放置20分钟，6000RPM离心15分钟，保留沉淀。 再次加入裂解液，超声破细胞后，加溶菌酶和Dnase, 上述过程重复三次。 用下述的溶液将包涵体悬浮，离心收集包涵体。 50mM Tris-HCl, pH 8.0 100mM NaCl 5mM EDTA 0.1% NaN3 用下述溶液悬浮包涵体，离心收集包涵体。 50mM Tris-HCl, pH 8.0 100mM NaCl 5mM EDTA 0.1% NaN3 1M 尿素 如暂时不用，放入－20℃保存。 包涵体的溶解 将包涵体悬浮在下述溶液中，4℃振荡过夜。 100mM Tris 50mM Glycine 8.5M 尿素 溶液用HCl调节到pH 8.0后加入 25mM DTT 6000RPM离心，取上清，去除不溶解物。 包涵体蛋白的复性 将溶解的包涵体装入透析袋，在4℃下将透析袋浸入下列溶液依次透析： 0.1M Tris 0.4M L-Arginine 1 mM EDTA 0.2mM PMSF 4M 尿素 溶液pH调节到8.0 透析24小时 0.1M Tris 0.4M L-Arginine 1 mM EDTA 0.2mM PMSF 2M 尿素 溶液pH调节到8.0 透析24小时 0.1M Tris 0.4M L-Arginine 1 mM EDTA 0.2mM PMSF 1M 尿素 溶液pH调节到8.0 透析24小时 0.1M Tris 0.4M L-Arginine 1 mM EDTA 0.2mM PMSF 0 M 尿素 溶液pH调节到8.0 透析24小时 0.025M Tris 0.1M L-Arginine 0.25 mM EDTA 0.2mM PMSF 0 M 尿素 溶液pH调节到8.0 透析24小时 10mM Tris-HCl pH8.0 150mM NaCl, 1mM EDTA 0.02% NaN3. 透析24小时 透析时注意透析袋的截留分子量 下面的工作就简单了，因为复性的蛋白已经在生理缓冲液中，进行阴阳离子交换层析爱怎么整就怎么整它了。 |
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