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本发明涉及生物技术领域，尤其是植物组织培养技术领域，具体涉及一种同时去除植物组织培养时外植体表面和内生菌的方法。
背景技术：
杨树属于杨柳科(Salicacae)杨属(Populus L.)植物，为多年生木本乔木。杨树不仅是重要的造林绿化树种和工业用材树种，而且还是多年生林木基因工程的模式树种。因此，获得大量无菌的外植体是进行杨树组织快繁和基因工程研究的前提和基础。
杨树树种为多年生木本植物，树体内部常寄生有各种细菌及真菌。内生菌由于受到植物体的保护，采用常规的消毒方式往往仅能杀灭表面病菌，对内生菌无能为力，因此常在培养后造成培养物的再次污染。同时，杨树树种的冬眠芽在萌发时分泌大量树脂，新生枝条、顶芽及侧芽表面也覆盖树脂，采用常规的水溶性消毒液，无法消除外植体表面树脂中及树脂下的细菌和真菌，因此常常导致外植体消毒不彻底、污染率较高或者消毒过度致使外植体死亡等情况发生。目前能够同时杀灭杨树表面及内生菌的消毒方法尚无报道，因此亟待开发一种能够同时去除植物组织培养时外植体表面和内生菌的高效安全的消毒方法。
技术实现要素：
本发明针对现有技术中存在的上述缺陷，为改善常规消毒灭菌方式无法去除杨树等外植体表面和内生菌的不足，提供了一种能够同时去除植物组织培养时外植体表面和内生菌的方法，该方法能够同时清除杨树等外植体表面及内部的细菌及真菌，使外植体保持充足的活力。
为此，本发明提供了一种同时去除植物组织培养时外植体表面和内生菌的方法，其包括以下步骤：
1、扦插土壤的消毒处理：采用50％的多菌灵对扦插土壤进行消毒处理。
2、扦插枝条的消毒处理：采用含有200mg/L两性霉素B和100mg/L硫酸链霉素的无菌水溶液对扦插枝条进行消毒处理，处理后，对扦插枝条进行顶端封腊处理。
3、外植体的选择和消毒预处理：采用含有100mg/L两性霉素B和50mg/L硫酸链霉素的无菌水溶液对半木质化的新发枝条进行预处理。
4、外植体的溶脂混合液预处理：采用溶脂混合液对外植体进行预处理5-6分钟。
5、外植体的表面灭菌。
(1)外植体的酒精灭菌处理。
(2)外植体的次氯酸钠灭菌处理。
(3)无菌水冲洗。
6、外植体的接种。
7、外植体的培养。
其中所述溶脂混合液为0.1％的吐温20和10％的乙酸乙酯的水溶液。
在本发明优选的实施方案中，扦插土壤的消毒处理为用50％的多菌灵，以30-40g/m3的用量与扦插土壤拌匀，装入塑料袋，密闭，5天后打开，阳光下晾晒2-3天。
在本发明优选的实施方案中，扦插枝条的消毒处理为将冬眠的穗条清洗后，剪成15cm长度，浸入含有200mg/L两性霉素B和100mg/L硫酸链霉素的无菌水溶液中，处理24小时后，进行顶端封腊处理，处理后扦插到营养钵中，移入温室内进行培养。
在本发明优选的实施方案中，外植体的选择和消毒预处理为剪取半木质化的新发枝条，插入含有100mg/L两性霉素B和50mg/L硫酸链霉素无菌水溶液中，处理12小时后，剪去叶片，采用1％的洗洁精溶液清洗，流水冲洗后，沥干水分，放入超净工作台。
在本发明优选的实施方案中，外植体的酒精灭菌处理为采用75％的酒精灭菌30秒。
在本发明优选的实施方案中，外植体的次氯酸钠灭菌为采用10％的次氯酸钠水溶液消毒8-10分钟。
在本发明优选的实施方案中，在对外植体进行接种之前，还包括在无菌条件下将外植体材料上与消毒剂接触过的界面进行切除的步骤。
在本发明优选的实施方案中，所述外植体的接种是将消毒灭菌后的外植体接种在添加100mg/L两性霉素B和50mg/L硫酸链霉素的MS启动培养基中。
在本发明优选的实施方案中，所述外植体培养的环境条件为光周期16h/8h、光照强度2500Lux、温度27℃/21℃。
在本发明优选的实施方案中，外植体为杨树的外植体，优选为欧美杨的外植体。
由上述描述可知，与现有技术相比，本发明采用50％的多菌灵对扦插土壤进行消毒处理，采用含有200mg/L两性霉素B和100mg/L硫酸链霉素的无菌水溶液对扦插枝条进行消毒处理，采用含有100mg/L两性霉素B和50mg/L硫酸链霉素的无菌水溶液对半木质化的新发枝条进行预处理，并且采用溶脂混合液对外植体进行预处理，从而能够有效清除杨树等外植体表面及内部的细菌及真菌，使外植体保持充足的活力。
附图说明
图1：采用常规消毒方法处理的欧美杨茎段外植体的生长状况。
A：培养15天后外植体产生细菌及真菌污染；
B：培养20天后外植体产生真菌污染。
图2：采用本发明的方法处理的欧美杨茎段外植体的生长状况。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明作进一步的详细说明，旨在用于说明本发明而非限定本发明。应当指出，对于本领域技术人员而言，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也同样落入本发明的保护范围之内。
实施例1：欧美杨外植体的培养
1、扦插土壤的消毒处理
将草炭土、珍珠岩和河沙按6:2:2的比例充分混合用作扦插土壤，施入50％多菌灵(30-40g/m3)，充分拌匀，装入塑料袋，密闭5天后打开，阳光下晾晒2-3天后，装入直径6cm的培养钵中。
2、扦插枝条的消毒处理
将冬眠的美洲黑杨穗条剪成15cm长度，自来水冲洗清除表面污垢。之后，将穗条全部浸入抗生素消毒混合液(200mg/L两性霉素B和100mg/L硫酸链霉素无菌水溶液)中，处理24小时。用无菌滤纸吸干穗条表面水分，并将穗条顶端1.5cm浸入融化的石蜡中，进行顶端封腊处理。处理后的穗条扦插到上述营养钵中，移入全自动日光温室内进行培养，期间进行日常的肥水管理和病虫害防治。
3、外植体的选择和消毒预处理
扦插30天后，选取生长健壮、无病虫害、腋芽饱满的杨树半木质化的新发枝条剪下，插入含有100mg/L两性霉素B和50mg/L硫酸链霉素无菌水溶液中处理12小时。
4、外植体的溶脂混合液预处理
外植体的抗生素消毒预处理后，用医用剪刀去除外植体叶片，保留2mm左右的叶柄，将外植体剪成2-3cm的小茎段，放入超净工作台，浸入50ml溶脂混合液(0.1％的吐温20和10％的乙酸乙酯无菌水溶液)中，处理6分钟。
5、外植体的表面灭菌
(1)外植体的酒精灭菌处理
将上述茎段取出，放入无菌培养皿中，倒入75％的酒精50ml，30秒后，迅速取出。
(2)外植体的次氯酸钠灭菌处理
将上述茎段取出,放入无菌培养皿中，倒入10％的次氯酸钠溶液50ml中，消毒8-10分钟，期间不停晃动。
(3)无菌水冲洗
将上述茎段移入无菌培养皿中，用无菌水冲洗外植体3次，用灭菌的滤纸吸干外植体表面的水分。
6、外植体的接种
用高温消毒过的医用手术剪刀，将茎段两端与消毒剂接触过的界面切除1-1.5mm，接种在添加100mg/L两性霉素B和50mg/L硫酸链霉素的MS启动培养基中。
7、外植体的培养
将培养瓶移入组织培养箱，设置培养箱的培养条件为光周期16h/8h，光照强度2500Lux，培养温度为27℃/21℃。
8、外植体培养结果的统计分析
培养15～30天期间，统计欧美杨外植体茎段的污染、成活及生长状况。不同消毒方法的结果比对具体如表1所示。
表1不同消毒方法结果对比
注：1：常规消毒方法；2：本发明的消毒方法
采用常规消毒方法处理的欧美杨茎段外植体的污染及生长状况如附图1所示；采用本发明的方法处理的欧美杨茎段外植体的生长状况如附图2所示。
