EGFR 抑制剂治疗结直肠癌的耐药标志物

摘要

表皮生长因子受体(EGFR)是治疗结直肠癌(colorectal cancer, CRC)的一个靶点，然而EGFR抑制剂似乎只对部分CRC病人有作用。EGFR抑制剂的耐药机制逐渐被认识。KRAS12号外显子活化突变在EGFR抑制剂的耐药方面占主导地位，约40%晚期结直肠癌病人发生该基因突变。其他可能的耐药机制包括配体表达、EGFR拷贝数增加、BRAF基因突变和其他信号通路的激活等。

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前言

结直肠癌是美国诊出率第四、死亡率第二的癌症，2102年的新发病例数为143,460例，死亡病例数为51,690例（1）。40-50%的初诊结直肠癌病人已经出现转移，说明全身的系统性治疗非常重要（2）。过去的10年中，奥沙利铂、伊立替康、西妥昔单抗、帕尼单抗、贝伐珠单抗、阿柏西普、瑞戈非尼等化疗药物（3-6）的批准上市，使得晚期结直肠癌患者的中位总生存期几乎翻倍—从5-FU时代的12个月延长至22个月左右。然而，这些药物的应用在大大增加了结直肠癌患者治疗费的同时，也带来了一系列的不良反应。这些因素促使基于耐药机制的生物标志物的研究，以使患者真正从特定治疗方案中获益。KRAS基因突变是对西妥昔单抗（7-9）和帕尼单抗（10-13）耐药的一个机制，它引领了结直肠癌个体化治疗的开始。大约40%的结直肠癌病人存在KRAS基因突变以及对EGFR抑制剂耐药。而KRAS基因野生型的存在使得病人不能从EGFR抑制剂的治疗中获益。因此，在KRAS野生型的转移性结直肠癌病人中，寻找那些能够识别无效以及初始有效，随后耐药的其他的耐药通路和可能的预测标志物显得尤为重要。

表皮生长因子受体(EGFR)

EGFR已被确定存在于多种人类上皮源性肿瘤，如头颈部鳞状细胞癌、结直肠癌、乳腺癌、胰腺癌、非小细胞肺癌和脑肿瘤。EGFR是一种170kDa的糖蛋白，其编码基因位于7号染色体p12。EGFR是人类表皮酪氨酸激酶受体（Her）家族的成员之一，Her家族包括EGFR (erbB1/Her1)，Her2/neu (erbB2)，Her3 (erbB3)，Her4 (erbB4)。EGFR包括一个胞外配体结合域(I、II、III、IV)，一个跨膜区，一个胞内近膜结构域和胞浆酪氨酸激酶结合域。EGFR结合配体（如EGF、TGFα、双调蛋白、肝素结合EGF、细胞调节素和上皮调节蛋白）后形成同源或异源二聚体，激活酪氨酸激酶结合域。在羧基终端尾部酪氨酸激酶介导酪氨酸磷酸化位点进行磷酸化。EGFR的活化激活多种复杂的胞内信号传导通路，而这些信号通路受配体、异源二聚体复合物、磷酸酪氨酸结合蛋白的调节。EGFR激活的两条主要信号通路是RAS-RAF-MAPK通路和PI3K-PTEN/PTEN/AKT通路（图1）。PI3K/AKT通路的激活促使蛋白质合成、细胞生长、存活和迁移。而RAS-RAF-MAPK通路则促使细胞周期性生长和增殖（14,15）。

图1 EGFR生物学。配体（图中为红色，epiregulin, amphiregulin）结合于EGFR的细胞外功能区，引起同源或异源性二聚体化，导致细胞浆尾部的酪氨酸残基（图中黄色部分）磷酸化。激活的EGFR导致KRAS活化，由此而顺序激活癌基因BRAF、MEK（分裂原活化蛋白激酶激酶）和MAPK（分裂原活化蛋白激酶），并导致促生长基因的表达。除了激活KRAS，EGFR还激活PIK3CA，后者依次将PIP2（2-磷酸-磷脂酰肌醇）磷酸化为PIP3（3-磷酸-磷脂酰肌醇）、激活AKT和几个下游的效应因子，导致蛋白质合成、细胞生长、存活、增值、迁移和血管生成。耐药机制已经被假说过，部分在该图中得到显示，miRNA-143在肿瘤细胞中表达较低，导致对KRAS的抑制减弱，肿瘤增值加快。红色方块代表EGFR配体（epiregulin, amphiregulin），红色线条代表抑制效应。

KRAS

人类KRAS癌基因同系物编码一种小GTP结合蛋白。细胞表面受体（包括EGFR）被活化后，此蛋白可在GDP和GTP结合状态的循环中起自我失活信号转到的作用。KRAS基因可庇护致癌性的突变并产生持续活化的蛋白。鉴于KRAS基因在EGFR信号传导通路中起关键性作用，因此，评估KRAS基因的突变影响并以此研究EGFR抑制剂的耐药机制是一种很好的方法。在结直肠癌中（包括原发灶和转移灶，不包括淋巴结），大约35%-45%病人存在KRAS基因12号外显子突变。多项回顾性研究发现KRAS基因突变型患者对抗EGFR治疗耐药（6,16）。这些研究的总结见表1。两项重要的EGFR抑制剂单药对比最佳支持治疗的研究显示KRAS基因突变在EGFR抑制剂耐药中所起的作用。在第一项研究（NCIC试验）中，572例化疗难治性的晚期结直肠癌患者被随机分成两组，分别为西妥昔单抗组和最佳支持治疗的三线治疗。结果显示西妥昔单抗可显著延长OS（HR，0.77；95% CI，0.64-0.92；P=0.005）和PFS （HR，0.68；95% CI，0.57-0.80；P<0.001）（5）。可取得标本的394例进行了亚组分析，结果显示，KRAS野生型的患者OS（中位9.5月 vs. 4.8月；HR，0.55；95% CI，0.41-0.74；P<0.001）和PFS （中位3.7月 vs. 1.9月；HR，0.40；95% CI，0.30-0.54；P<0.001）明显延长。相对于最佳支持治疗来讲，KRAS突变型患者的OS和PFS并未从西妥昔单抗的治疗中获益（27）。另外一项帕尼单抗对比最佳支持治疗在化疗难治性结直肠癌的随机对照临床研究中也得出相似结果。KRAS野生型患者接受帕尼单抗治疗的PFS为8周，较最佳支持治疗组（7.3周）长（HR，0.54；95% CI，0.44-0.66；P<0.0001）。帕尼单抗组的有效率为10%，而最佳支持治疗组为0（P<0.0001）。KRAS突变型患者接受帕尼单抗治疗的OS并未较最佳支持治疗组延长（HR，1.00；95% CI，0.82 to 1.22）（26）。

在CRYSTAL研究中，1,198例初治的晚期结直肠癌患者被随机分成两组，分别接受西妥昔单抗 FOLFIRI或FOLFIRI治疗。结果显示西妥昔单抗 FOLFIRI组的PFS较FOLFIRI组延长（HR，0.85；95% CI，0.72-0.99；P=0.048），而两组的OS没有差别（HR，0.93；95% CI，0.81 to 1.07；P=0.31）。亚组分析显示，KRAS突变型患者（37%）接受西妥昔单抗 FOLFIRI治疗后，其OS（HR，1.03）和PFS（HR，1.07；P=0.75）都没有延长。KRAS野生型患者接受西妥昔单抗 FOLFIRI治疗后的PFS为9.9月，FOLFIRI组为8.4月（HR，0.68；95% CI，0.50-0.94；P=0.02）；而两组的OS分别为23.5月和20.0月（HR，0.84；P=0.0093）；两组的有效率分别为57.3%和39.7%（P=0.001）。这项研究的结果使西妥昔单抗被批准联合FOLFIRI一线治疗KRAS野生型的转移性结直肠癌（6,25）。

大约6%的结直肠癌病人存在KRAS基因13号密码子突变。13号密码子突变对产生EGFR抑制剂耐药的影响仍然是有争论的。有体外实验显示KRAS13号密码子突变较12号密码子突变有更低的转化活性，对凋亡和生长能力的耐药性更低（28）。DeRoock等人研究了应用西妥昔单抗治疗的难治性结直肠癌病人的p.G13D突变与有效率及生存期的关系。p.G13D突变者有更长的OS（7.6月vs.5.7月，P=0.005）和PFS（4.0月vs.1.9月，P=0.004）。虽然这些结果提示p.G13D突变的病人对西妥昔单抗治疗有效，但其有效率仍然低于KRAS野生型病人。在此研究中，体外实验和小鼠模型均提示p.G12V突变的结直肠癌细胞对西妥昔单抗不敏感，而p.G13D突变的细胞和KRAS野生型对西妥昔单抗是敏感的（21）。Peeters等在三项帕尼单抗治疗晚期结直肠癌的临床试验中分析了KRAS基因13号密码子的突变状态。结果显示13号密码子突变的病人对帕尼单抗治疗无效。KRAS基因13号密码子突变对EGFR抑制剂存在不同的敏感性的原因可能是应用不同的药物（帕尼单抗和西妥昔单抗），或者是13号密码子突变与不同化疗药物之间存在不一样的相互作用。在这方面，由于缺乏前瞻性的临床试验，13号密码子突变对EGFR抑制剂耐药的影响仍然是有争论的（29）。

KRAS之外的耐药机制

大约一半的KRAS基因野生型患者对抗EGFR治疗无效，因此，除了KRAS基因突变，还有其他因素影响耐药性的产生。这些因素包括EGFR配体表达增加、EGFR表达降低、其他信号传导通路的激活等。

EGFR、上皮调节蛋白和双调蛋白的表达水平

Baker等分析了原发灶活检组织的KRAS和EGFR配体基因的表达情况（用同一组病人的转移灶活检标本进行了验证）。结果显示有43%病人存在KRAS基因突变。KRAS野生型病人对EGFR抑制剂的敏感性与EGFR配体、上皮调节蛋白和双调蛋白的表达水平呈正相关关系。EGFR配体表达水平高的KRAS野生型病人使用抗EGFR治疗有效率高，EGFR配体表达水平低的KRAS野生型病人有效率低，接近KRAS突变型病人。另外，相比上皮调节蛋白（P=0.0002）和双调蛋白（P=0.0001）表达水平低的病人，EGFR配体表达水平高的KRAS野生型病人有更高的疾病控制率和PFS（30）。在KRAS突变型肿瘤中，并没有证据证明上皮调节蛋白和双调蛋白的表达水平与OS和PFS之间存在相关性（31）。在EGFR配体上皮调节蛋白和双调蛋白mRNA高表达的病人中，西妥昔单抗有更高的抗肿瘤活性。因此，在EGFR配体的低表达可能是抗EGFR治疗耐药的其中一个机制，提示EGFR系统可能并不是控制肿瘤生长或进展的主要因素。

EGFR表达

最初在EGFR抑制剂的应用中，只选择免疫组化确认EGFR表达阳性的病人入组临床试验。这是基于这样一个概念：如果EGFR不表达，那么EGFR抑制剂就会耐药。在Ghung等人进行的研究中，16位病人中有4位EGFR表达阴性，但对西妥昔单抗为基础的治疗均有明显疗效（32）。因此，使用免疫组化的方法检测EGFR的表达情况并不能预测EGFR抑制剂的耐药情况。

另外，也有研究应用分子生物学的方法检测EGFR的表达，验证其是否影响EGFR抑制剂的耐药。Moroni等人进行了一项研究，对31例使用西妥昔单抗或帕尼单抗治疗的转移性结直肠癌患者进行EGFR基因拷贝数的检测，其中，有效或稳定的病人占30%，进展的病人占70%。9位治疗有效的病人中，有8位病人的EGFR基因拷贝数增加。另一方面，21位治疗无效的病人中，只有1位病人的EGFR基因拷贝数增加（P<0.0001）（33）。提示EGFR基因拷贝数可以作为EGFR抑制剂疗效预测的指标。EGFR基因拷贝数＜2.5/细胞核或者＜40%细胞提示肿瘤内7号染色体多体性，有更短的PFS（P=0.039）和OS（P=0.015）（34）。Lenz等人用PCR法代替FISH法检测对西妥昔单抗治疗有效病人的EGFR基因拷贝数，并未发现基因拷贝数与有效率及PFS之间有相关性，但与OS之间存在相关性（35）。有回顾性研究用FISH法检测了85例接受西妥昔单抗治疗的难治性结直肠癌患者的EGFR基因拷贝数，发现基因拷贝数高的病人有较高的有效率和较长的PFS，评价的基因拷贝数为2.92（36,37）。在Lievre等人进行的研究中，用显色原位杂交法(CGH)检测EGFR基因拷贝数，结果发现基因拷贝数高的病人使用西妥昔单抗治疗的有效率高。然而，由于基因拷贝数高的病人数太少，使其结论受到质疑（38）。大规模的调查显示EGFR基因拷贝数升高的病人占6%，与疾病控制率并无相关性（33）。最近的一项Meta分析显示EGFR基因拷贝数升高的转移性结直肠癌病人接受抗EGFR治疗后的生存期较长（39）。总的来说，用目前的数据证实EGFR基因拷贝数对于EGFR抑制剂耐药的作用存在不一致性，这主要是因为存在不同的检测方法、不确定的阈值以及缺少标准化。由于存在不同的检测方法（FISH、qPCR或者CGH），使得结果的可比性较差。

BRAF

苏氨酸蛋白激酶BRAF是KRAS的主要效应器。BRAF突变发生在KRAS的下游通路上，在结直肠癌里的发生率不到10%。不同基因的体细胞突变使病人有不同的生存期：BRAF突变型，8.8月；KRAS突变型，14.4月；KRAS野生型，20.1月（40）。在接受单独FOLFIRI治疗和FOLFIRI联合西妥昔单抗治疗的病人中，KRAS野生型、BRAF V600E突变型的病人预后较差；BRAF突变的患者效果也较差。V600E突变约占6%。在CRYSTAL研究中，对KRAS野生型的肿瘤进行了BRAF突变的检测，结果显示BRAF突变状态与抗EGFR治疗的疗效相关。BRAF突变是有效率低和生存期短的预测因子。然而，此研究中BRAF突变的病人数很少，还难以肯定BRAF突变是西妥昔单抗的疗效预测因子（6）。在其他的研究中发现，BRAF突变是转移性结直肠癌生存期短的预后因子（41,42）。在NORDIC VII研究中，相对于BRAF野生型来说，BRAF突变型病人的有效率更低、PFS和OS更短（43）。一项回顾性研究分析了113例接受西妥昔单抗或帕尼单抗治疗的病人，探索KRAS和BRAF基因突变状态与有效率、PFS和OS之间的关系。在KRAS野生型中，BRAF V600E突变占14%。没有一例BRAF突变型的病人对抗EGFR治疗有效，而且PFS和OS更短。BRAF突变在抗EGFR治疗中的地位与KRAS突变相似（44）。而且，MSI-H的患者中有50%存在BRAF突变，MSS患者只有12%存在BRAF突变（45-47）。BRAF抑制剂-威罗菲尼(vemurafenib)的疗效也是很有限的。有人认为这是因为抑制BRAF后，EGFR被激活更多。而黑色素瘤细胞表面表达低水平的EGFR，可能导致了疗效的差异（48-52）。一项体外实验显示联合应用索拉非尼和EGFR抑制剂，可以对BRAF突变的结直肠癌细胞有潜在的抑制作用，而单独使用则无明显效果。这些数据表明对于BRAF突变型的肿瘤，可以通过阻断EGFR通路上的多个位点来恢复西妥昔单抗或帕尼单抗的治疗效果。除索拉非尼外，以BRAF (PLX4032)及其下游效应器作为靶点的药物，如ARRY-162、AZD6244和PD0325901等都在进行与EGFR抗体联治疗合的临床试验（53,54）。尽管KRAS和BRAF都是野生型，仍然有41%的患者对EGFR抑制剂无效。因此，研究其他通路对EGFR抑制剂耐药的影响显得尤为重要（44）。

PIK3基因

一项评价西妥昔单抗联合化疗治疗化疗难治性结直肠癌病人的研究的结果显示，PIK3CA基因20号外显子突变的病人疗效较野生型差；而PIK3CA 9号外显子突变与疗效之间无相关性（40）。另外一项综述分析了接受EGFR抑制剂治疗的转移性结直肠癌患者的PIK3CA突变状态与疗效的关系，也得出了相似的结果。这些结果提示在KRAS野生型的转移性结直肠癌患者中，PIK3CA 基因20号外显子突变状态是预测EGFR抑制剂耐药的潜在标志物（55）。由于PIK3CA突变与KRAS突变是共同存在的，因此它可以影响EGFR抑制剂的耐药性。然而，很难确定它们之间一对一的关系。PIK3CA的热点突变，尤其是螺旋和激酶结合域的突变，可能产生与KRAS不同的，但具有协同性的耐药机制（56）。简而言之，PIK3CA突变对EGFR抑制剂耐药的影响还是存在争论的。

一项研究对200例接受西妥昔单抗治疗的KRAS野生型的转移性结直肠癌病人进行了PIK3CA检测，结果发现PIK3CA突变状态对疗效没有影响（57）。PIK3CA突变占16.4%。PIK3CA突变偶尔与其他基因的突变共存。单因素分析显示，影响总生存的预后因子包括：BRAF突变、KRAS基因12号外显子突变、KRAS野生型中双调蛋白高表达、所有患者中的上皮调节蛋白高表达。有效的预测因子包括：KRAS野生型中双调蛋白mRNA高表达、上皮调节蛋白mRNA高表达、肝配蛋白A2受体mRNA低表达。双调蛋白低表达的KRAS野生型病人接受西妥昔单抗治疗后的疗效差，其生存期与KRAS突变型的患者相似；KRAS基因13号密码子突变或其他非12号密码子突变病人的中位生存期与KRAS野生型相似。此结果与之前认为KRAS基因12号密码子突变的生存期最差的观点不一致（58）。根据靶向治疗的研究结果，KRAS突变对PI3K通路的抑制剂耐药（59）。KRAS突变提示对PI3K抑制剂（PX-866）耐药（60）。这限制了单纯的PI3K抑制剂在同时存在KRAS和PIK3CA突变的结肠癌中的应用（61）。

PTEN

PIK3通路中一些基因的活化（如PIK3CA和AKT1），或者是PTEN基因的缺失，可以强化PI3K信号传导（62-64）。具有微卫星不稳定性的结直肠癌患者中，大约有18%存在PTEN基因突变，提示PTEN基因的错配修复缺失可能是一个潜在的治疗靶点（65,66）。进一步的研究提示在微卫星不稳定性高的病人中，PTEN启动子高甲基化的比率高于微卫星不稳定性低的病人（19.1% vs. 2.2%；P=0.002）（67）。一项研究对KRAS、BRAF和PTEN进行了联合分析，结果显示39%患者的KRAS、BRAF和PTEN均为野生型，这部分难治性患者接受西妥昔单抗治疗的有效率可高达45%。而PTEN突变的患者对西妥昔单抗耐药（68）。

MAPK

KRAS-MAPK-PI3KCA通路的交叉对肿瘤的发生有非常复杂的影响。KRAS的突变率决定于2号外显子，其中12和13号密码子是最常见的突变（69）。MAPK信号通路中的基因变异可影响结直肠癌的发生，而环境和生活方式（如阿司匹林或非甾体类消炎药的使用、吸烟、雌激素水平和体重指数）可影响其基因变异（70）。在KRAS肺癌模型中，使用PI3K/mTOR抑制剂（NVP-BEZ235）和MEK抑制剂（ARRY-142886）来同时抑制PI3K和MAPK通路使肿瘤显著缩小（59）。

MEK

MEK是KRAS下游的另外一个靶点。MEK激活胞外的信号调节激酶（ERK-1和ERK-2），这些激酶与控制细胞周期从G期到S期的因子的磷酸化起应答反应。另外一种细胞外信号调节激酶1/2（ERK1/2）的活化可以通过胞浆膜或者下游组件使EGFR产生旁路，从而获得对EGFR抑制剂的耐药性。通过培养西妥昔单抗耐药细胞株，Yonesaka等第一次鉴定出应用西妥昔单抗后低抑制ERK1/2磷酸化的多克隆。进一步的研究发现这些克隆使ERBB2扩增增加，包括总的和磷酸化的ERBB2水平。随后，在耐药细胞株中抑制ERBB2后可重新获得对西妥昔单抗的敏感性。这肯定了ERBB2在耐药机制中的重要性。ERBB2扩增被认为是对西妥昔单抗耐药的一个机制，这种获得性耐药是通过一种结合ERBB3和ERBB4的配体-调蛋白来介导的。这使得下游通路的靶点活化，而这种配体的作用仍有待进一步研究（71）。近来的分子分析认为，KRAS的分子改变导致了EGFR抑制剂获得性耐药的产生。西妥昔单抗治疗的突变KRAS等位基因的检测比疾病进展的影像学证据早10个月。有证据表明早期联合使用EGFR抑制剂和MEK抑制剂可以延缓或逆转耐药性的产生（72）。

IGF1

胰岛素样生长因子受体-1（IGF-1R）包括胰岛素受体和胰岛素受体相关受体在内的跨膜酪氨酸激酶家族的一员。在不同的肿瘤中，IGF-1R信号通路是非常重要的，它通过MAPK和PI3K参与了IGF信号的转导。临床前研究证实联合使用IGF1-R和EGFR抑制剂可对结直肠癌细胞的生长产生协同抑制作用（73）。有证据表明，IGF-1R和EGFR之间的相互作用，对于EGFR的促有丝分裂和转化活性是至关重要的。更具体地说，IGF-1下游信号的级联反应被认为可以诱发EGFR非依赖性的PIK3CA和AKT活性，这从另外一个方面解释了为什么有些KRAS野生型患者对抗EGFR的单克隆抗体治疗无效（74）。Bohula等人的研究支持了这一点。他们的实验证明了IGF-1和IGF-2可以产生蛋白激素，与IGF-1R起相互作用，调节细胞的生长、分化和存活。IGF-1R激活RAS/ERK和PI3K/AKT相关的信号转导通路，起到加速增殖、减少凋亡的作用（75）。一项在西妥昔单抗或帕尼单抗治疗失败的病人中使用抗IGF-1R单克隆抗体（IMC-A12）单药或联合西妥昔单抗的II期临床试验正在进行中。在23例单纯应用IMC-A12的患者中均未看到抗肿瘤活性。而在21例联合使用IMC-A12和西妥昔单抗的患者中，有1例KRAS野生型患者部分有效，疾病控制时间为6.5月。联合治疗中，没有看到其他的抗肿瘤活性（76）。在BRAF突变的结直肠癌临床前模型中，同时阻断IGF-1R和MEK有效地抑制了EGFR-IGF1R之间的相互作用（77）。

结论

虽然EGFR靶向治疗发展迅速，但是在结直肠癌治疗的耐药机制方面还有很多需要研究。显然，KRAS基因12号密码子突变是EGFR抑制剂耐药的一个主要原因。在KRAS野生型中，很多因素与耐药有关，包括配体的表达水平、PI3K或IGFR-1通路的激活。RAS基因13号密码子突变和BRAF突变也是EGFR抑制剂耐药的一个机制，值得进一步研究。确定EGFR抑制剂的耐药机制有助于我们选择病人进行个体化治疗以及发展新的联合治疗手段来克服当前治疗的耐药问题。