解密||在现场扩培中“菌膜”和“pH”是判断发酵成功的关键因素吗？

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乳酸菌、EM菌等液体产品普遍存在运输成本高、菌量衰减较快等问题，鉴于乳酸菌易扩培和降低使用成本两方面考虑，近两年水产动保公司纷纷推出了现场扩培用菌包（粉剂为主），根据产品含量和温度不同，养殖户在现场采用简易装置进行密封发酵1-3天，获得数百倍体积的乳酸菌或复合菌产品，使用面积扩大数十倍，在实践中获得了良好的推广。但因养殖户无法直接检测活菌含量，基本通过pH试纸测定发酵液pH、观察上层菌膜、嗅气味等感官指标判断发酵是否成功（部分可采用显微镜简单观察菌的数量），但非生物类专业人士对菌膜、气味等蕴含的真谛很难接触到。本文就菌包中酵母菌含量及配套培养基配方对扩培外观、pH和菌量的影响进行了对比，帮助养殖户更好的评价发酵指标进而更深入得了解此类产品。

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 材料与方法                

1.1 实验材料和仪器  

菌包和培养基、北京陆桥MRS培养基和孟加拉红培养基、雷磁pH计、博迅隔水式恒温培养箱、10L带盖小白桶等实验用品由青岛根源生物集团技术支持中心提供。

1.2 实验方法

将菌包、培养基、曝气后洁净的自来水按1kg:1kg:100L称量后放于小白桶内，混合均匀、加盖后，室温25-26℃发酵48h。在发酵初期、24h和48h采用pH计测定菌液pH，并在发酵结束后观察菌膜情况、测定乳酸菌含量。乳酸菌计数采用十倍梯度稀释法稀释，取合适梯度用MRS培养基倾注后，37℃培养48h，每毫升发酵液活菌数（CFU）=平板菌落平均数×稀释倍数。

实验首先选择在同一培养基中，比较菌包中添加不同含量酵母菌对发酵的影响，酵母菌添加量分别设置：5.0×10⁵CFU/g、1.5×10⁶ CFU/g、2.5×10⁶ CFU/g、5.0×10⁶ CFU/g、1.0×10⁷ CFU/g。

然后在同一菌包配方下比较不同培养基配方对发酵的影响，配方分别为：配方1主要由葡萄糖、蔗糖和淀粉等组成；配方2主要由红糖组成；配方3主要由葡萄糖、玉米浆干粉和豆粕等组成；配方4由豆粕、红糖和玉米皮粉等组成。

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结果与分析                     

2.1 菌包中酵母菌含量对发酵的影响

实验结果表明，不同酵母菌添加量初始pH值均为6.01左右，发酵24h后降低到3.5以下，48h后降低到3.0左右，不同添加量之间pH无显著差异（P＞0.05）。发酵48h后各组乳酸菌菌量差异显著（P＜0.05），其中配方中添加1.5×10⁶ CFU/g和2.5×10⁶ CFU/g的酵母菌组发酵菌量最高，随着酵母添加量的增加发酵后乳酸菌菌量降低。

表1  不同酵母菌添加量对发酵pH和乳酸菌菌量影响

同一培养基下，菌包中酵母菌含量直接影响发酵后外观，5.0×10⁶ CFU/g时，发酵后表面有一层厚厚的白膜，随酵母菌添加量的增加，膜厚度变薄，增加至2.5×10⁶ CFU/g时，发酵后白膜厚度适中且表面有微量气泡，继续增加酵母用量，发酵表面气泡增加、白膜变薄（图1）

图1 不同酵母添加量发酵48h外观差异

2.2 不同培养基对发酵的影响

实验表明，实验中不同培养基组初始pH有一定差异，由配方原料pH不同引起，整体pH在6-6.5之间。发酵48h后各组间pH有显著差异（P＜0.05），配方1最低，达到3.06，初始pH最低的配方4发酵后pH却最高，为4.35（图2）。

发酵48h后4种配方的乳酸菌含量有显著差异（P＜0.05），配方4乳酸菌含量最高，达到10.6亿/mL，比仅由红糖组成的配方2菌量高7倍（图3）,因此并非发酵后pH越低菌量越高，乳酸菌利用糖作为碳源发酵可产生乳酸、醋酸等有机酸，使发酵液pH降低，但随着 pH 值下降，乳酸菌的活力及繁殖受到反馈抑制，限制了菌量继续提升。

图2 菌包在不同培养基中发酵后pH比较

图3 菌包在不同培养基中发酵后乳酸菌比较

对发酵后上层菌膜进行观察显示，不同培养基发酵后外观差异很大，用配方1发酵后有薄膜，用纯红糖发酵后仅有气泡无膜（配方2），而用豆粕等有机原料发酵的配方3和4有膜但厚薄不一（图3、图4）。通过显微镜观察发现，白膜中主要是酵母菌，发酵液中则乳酸菌为主，有少量酵母（图5）。白膜主要是酵母菌少量繁殖产气后与部分小颗粒有机载体在发酵过程中上浮形成一层膜，乳酸菌是兼性厌氧菌，自然放置时主要在水体中下层，在上层膜中占比很少。

图4 不同培养基发酵外观差异

图5-1  白膜镜检    5-2发酵液镜检

3 讨论

市场动保产品鱼龙混杂，乳酸菌类产品扩培看似简单、门槛低，且市场需求量大，造成市场产品种类繁杂，多见厂家提供发酵菌包，养殖现场自配红糖进行发酵。因现场条件有限只能通过观察白膜、采用试纸测定pH和闻酸香味的方法简单判断发酵是否成功，但白膜到底是什么、pH低到多少最好，分辨这些有一定难度。

如菌包中不添加酵母仅添加乳酸菌时，因乳酸菌喜好在水体中下层厌氧环境生长，发酵后菌液上层不产生菌膜。而菌包中添加酵母的情况下，菌膜情况因酵母添加量和培养基成分有所不同，采用红糖做培养基，可观察到酵母产生的气泡，因红糖可溶性较好表面不会形成白膜。使用不溶性有机物如豆粕等做培养基，酵母菌添加偏少时，稍有气泡产生，则底层有机物大量上浮，白膜较厚；酵母菌添加过多时，气泡丰富，气泡翻腾搅动水体，微细有机物颗粒难以浮在菌液表面，因此表面也无白膜。现场发酵时产生白膜只是一种特定发酵条件下的现象，不是发酵成功和发酵深度的判定标准。

现场发酵因水温条件、培养基添加量等添加限制，扩培后菌量在1~5亿CFU/mL，过程中乳酸菌繁殖10倍左右，当然发酵水平显著低于规范的发酵罐中菌量（几十~一百亿/mL），但对养殖户来说，有效浓度扩增10倍会显著降低使用成本，非常值得推荐。在这同时，需要辩证得看待发酵成功的标准，以及菌种和培养基成本。pH不是越低越好，这与菌种有关，菌膜不是发酵成功的必要条件，此外因菌的发酵需要营养平衡，单纯的以某一种原料比如红糖做培养基，发酵后pH较低，但菌量明显不足，本实验中发酵后乳酸菌菌量为1.5亿CFU/mL，远远低于其它同时复配多种碳源和氮源的各组。养殖户在实际扩培时应避开宣传陷阱，慎重选择发酵产品和应用方法。

作者：刘宝同