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茅益民 上海交通大学医学院附属仁济医院 上海市消化疾病研究所 上海市脂肪性肝病诊治研究中心 上海交通大学医学院临床研究中心 随着肥胖、糖尿病在全球范围内的流行，非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）的发病率也显著升高，普通人群的发病率达到约25%，已成为全球最为普遍的慢性肝病。不同于其他慢性肝病，NAFLD不仅病变在肝脏，其疾病谱中的非酒精性脂肪性肝炎（NASH）有进展为肝硬化甚至肝癌的风险；而且，现有证据显示，独立于肝损伤程度，NAFLD患者出现的肝细胞脂肪变，不仅使2型糖尿病发病率增加，使其与肥胖、糖尿病等代谢综合征（MS）密切关联、互为因果，同时还增加了心脑血管疾病及死亡的风险。因此，开发有效的药物进行干预，阻止疾病进展就显得尤为重要。 尽管至今尚无食品药品监督管理局批准的药物专门用于NASH治疗，但针对脂肪沉积及代谢应激、抗氧化以及NASH炎症和损伤通路、肝纤维化和肠道等不同靶向的大量治疗NASH的新药处于不同的研发阶段，有的已步入临床研发阶段，正在开展不同期别的临床试验。制订科学、具有可操作性的临床试验方案，有助于科学、客观、公正地评价新药的有效性和安全性，对新药的成功研发具有重要意义。本文将重点讨论NASH新药探索性（Ⅱa期）和确证性临床试验（Ⅲ期）中方案设计的相关问题。 1 探索性和确证性临床试验与新药研发 不同于仿制药的研发，新药的研发过程通常是基于前期研究基础而逐步向后期研发推进的逻辑过程。了解不同阶段临床试验和新药研发的整体关系，对新药研发策略的决策和方案设计的制订，具有重要意义。 临床研发早期阶段的探索性临床试验的主要目的:(1)评估在目标NASH患者中的初步有效性，即概念验证性试验（Proof of Concept)；(2)开展药效/药代动力学研究（PD/PK）；(3)基于临床前和前期临床试验提供的依据，在NASH患者中进行最佳剂量、疗程或者合适治疗人群等的探索，为后续的临床试验（Ⅱb期）或确证性临床试验提供依据。通常，在创新药的研发过程中，探索性研究越充分，越能提供足够的信息，利于后续的研发决策和策略的正确制订。实践中，应综合考量研发效率、研发成本，根据每个新药的不同特点，基于不同的研究目的，开展一项或多项探索性试验。 确证性临床试验是新药注册的关键临床试验。通常，在此阶段，合适的治疗人群、新药的最佳治疗剂量等已经过前期系列研究后确定，其主要目的是在目标NASH患者中确证新药的有效性和安全性，为注册上市提供依据。 2 探索性和确证性临床试验方案设计的方法学考虑 在某一特定临床试验的方案设计中，首先应考虑整体设计的方法学，如统计学的假设是什么、是否及如何随机、设计是开放的还是盲法、是否设置对照及如何选择对照、如何确定样本量、如何选择主要研究终点等。同时，设计方案时应关注伦理学问题，根据临床试验质量管理规范，伦理学和科学是2个重要的核心，保障受试者权益是需要考量的第一要素，高于对科学探索的需求。 探索性临床试验阶段，由于其主要目的是为后续研究提供依据，可以根据不同的探索目的设计方案，与确证性临床试验相比，探索性临床试验方案设计更为灵活，且开放性也更大。研究设计可以是随机开放的，也可以是双盲、安慰剂对照的设计；主要研究终点可以选择基于组织学的替代终点，也可以选择与NASH发病机制、新药作用机制相关的生物标记作为替代终点；样本量可大可小，以满足不同探索性临床试验的最低统计学要求。 Ⅲ期的确证性临床试验是评价一个新药有效性和安全性的最终决定性阶段，方案设计需有严格的要求。通常，需要随机、双盲、安慰剂对照设计；主要研究终点应选择基于组织学的替代终点；剂量选择的依据要在方案中明确；需基于前期临床试验有效性结果，估算样本量，以满足“新药有效”的统计学假设。值得注意的是，尽管在多数临床试验中以药物的有效性估算样本量，但如果在前期的研究中出现潜在重要脏器的安全性隐患，需要在确证性临床试验阶段进行重点评估时，应根据该安全性隐患出现的频率去估算样本量，以保证在足够暴露的前提下评估其安全性。通常，在以安全性评价为目的的临床试验中，尤其是发生频率并不很高时，样本量往往会很大。 3 方案设计时的主要关注 确定了探索性和确证性临床试验整体设计的方法学后，需综合考虑的问题涉及所研究的新药和所治疗的目标适应证（NASH）。前者包括新药的靶向作用机制、临床定位（如单药还是联合）、前期系列研究提供的支持后续临床试验开展的与新药相关的依据（如新药的剂量如何设定、新药的用法）等；后者则包括NASH的流行病学、临床表型、当前的临床诊断和评估方法、治疗手段等。下述方面因直接涉及新药的有效性和安全性评价，应予重点关注。 3.1 关于研究人群 现有证据表明，约30%的NASH患者有进展为肝硬化甚至肝癌的风险，而且，无论是否为NASH，进展期纤维化患者或NASH相关肝硬化患者的全因死亡和肝脏相关死亡风险明显增高。因此，有肝脏病变进展风险的NASH人群和具有较高死亡风险的进展期肝纤维化或NASH相关肝硬化人群，符合临床治疗学原则，需要接受药物治疗，以减少肝脏病变进展风险，改善临床结局。因此，在NASH的探索性和确证性临床试验中，NASH人群和伴有进展期肝纤维化/肝硬化人群是目标研究人群。而且，目前NASH领域的新药，无论其具体作用机制和靶向如何，基本可归纳为抗NASH或抗肝纤维化两大方向。
与所有其他新药的临床试验一样，在方案制订中，纳入研究的患者应明确界定学术界目前公认的诊断标准。无论是NASH还是肝纤维化，目前临床诊断的金标准是肝组织学，因此，对所有纳入治疗NASH新药确证性临床试验患者，应提供肝组织学证据。入组前3~6个月内已行肝组织学检查确诊的患者，考虑到其在短时间内进展风险相对较小，在多数目前开展的临床试验中，往往能被接受。基于临床、血清、影像学等技术的NASH和肝纤维化无创诊断技术，近年有较大发展，但迄今尚无法代替金标准组织学，在临床试验中可作为提高NASH和肝纤维化筛查效率的辅助诊断工具。 尽管普遍认为大泡性脂肪变、小叶炎症、肝细胞的气球样变性和3带窦周纤维化是NASH组织学的典型表现，但挑战性的问题在于NASH的组织学定义学术界尚未达成共识。迄今，共提出了多种组织学标准用于NASH的诊断：Matteoni、Brunt、Mendler、Kleiner( NASH CRN，NAS)和新近推出的SAF。同一患者如采用不同方法确认是否为NASH，诊断结果可能会不一致。因此，在NASH的药物临床试验中可能会错误入选一部分非NASH患者，从而影响研究结论。 如果新药临床主要定位于治疗NASH相关肝硬化，另一挑战性的问题是临床诊断。因为，对于一个NASH相关肝硬化患者而言，即使肝脏组织学提示有假小叶形成的肝硬化表现，但组织学脂肪变的改变可能已经消失，此时建立的NASH相关肝硬化诊断，依据的是有明确的脂肪肝病史，并排除了其他引起肝硬化的病因。尽管临床实践中常常将隐源性肝硬化归因于NASH，但事实上并不清楚隐源性肝硬化的人群中有多少是真正由NASH导致的。因此，在实践中可能会将其他潜在病因尤其是少见或罕见病因引起的肝硬化错误地诊断为NASH相关肝硬化，尤其是对有脂肪肝病史的患者。
就肝脏病变而言，尽管达到诊断标准，但每一个NASH患者组织学的脂肪变、小叶炎症和气球样变严重程度都不尽相同；有的NASH患者无肝纤维化，而有的则已出现不同程度的肝纤维化，甚至肝硬化。就MS而言，有的NASH患者无肥胖和糖尿病等MS表现，而有的则可能伴随一种或多种MS组份；就心脑血管风险而言，有的NASH患者尚无这方面风险，而有的则已启动动脉硬化进程并伴随不同程度的心脑血管事件风险。因此，临床上肝脏和肝外病变不同严重程度组合，决定了NASH临床表型是非常复杂的。 那么，方案设计中是否所有组织学确诊的NASH患者都可纳入、是否纳入NASH同时伴随肝纤维化（什么程度的肝纤维化）患者、是否纳入NASH同时伴随肥胖和糖尿病等MS患者、是否应对伴随的MS有专门限定、是否纳入的进展期肝纤维化患者必须伴随NASH等，事实上，所有这些问题并没有统一的、简单的答案。一个NASH的新药，可能对所有的NASH表型都有效，也可能只是对某个NASH表型有效。一个有效的新药在不合适（无效）的人群中开展研究，得到的结果只能是阴性的结果，从而错误地判断此药无效。因此，针对方案设计中目标研究人群上述问题的考虑，其实是希望找到一个NASH新药的合适治疗人群，这对新药成功研发是非常重要的。在实践中，往往需要针对每一个新药进行独立评估，综合考虑新药的作用靶点、临床定位、临床前研究和前期临床研究的有效性和安全性方面信息等而决定，从而锁定纳入临床试验的真正合适的患者群体。 疑似NASH患者是否应该纳入是个有争议的话题。疑似NASH是否一定会进展为真正的NASH，进而进一步导致肝脏病变进展或导致严重不良临床结局的发生，目前并不清楚。同样，也不清楚疑似NASH患者和确诊NASH患者的自然转归是否一致。纳入一些貌似更“轻”的疑似NASH患者，对于新药研发是存在风险的，因为这些疑似患者可能并不会进展或进展速度极其缓慢，这样和安慰剂相比就可能无法评价出新药的疗效了，尤其是对于那些药效作用本身并不很强的新药。为避免这种影响，即使在一项临床试验中同时纳入了疑似和确诊NASH患者，应进行对应的分层统计分析来分别评估。 3.2 关于研究终点
与其他可导致死亡的慢性疾病一样，最重要的临床结局是全因死亡率。因此，生存率的提高或全因死亡率的降低，是NASH临床试验的一个重要硬终点。肝脏相关死亡率是全因死亡率的一个组成部分，常与进展为肝硬化、出现失代偿的相关并发症（腹水、食管胃底静脉曲张出血、肝性脑病和肝肾综合征等）和进展为肝癌密切相关。一旦患者出现了上述硬终点事件，通常意味着患者的死亡风险显著增加。因此，对于一个NASH治疗药物而言，只有被证明可以真正有效阻止疾病进展，治疗后肝硬化、出现失代偿的相关并发症和进展为肝癌的风险显著降低，进而降低了全因死亡率和肝脏相关死亡率，这样的药物才是真正有效的药物，因为，这反映了患者经过药物治疗后改变了NASH自然史，其获益是改善了最终的临床结局。 尽管全因和肝脏相关死亡率降低是理想的治疗硬终点，然而，NASH 进展为肝硬化的过程通常非常缓慢，其中15%~20%的患者需要数十年才进展为肝硬化，因此，如果以全因和肝脏相关死亡率降低作为主要研究终点，对大部分早期 NASH 患者可能需要随访至少长达 10~15 年才能看到新药的效应，这在新药研发和审批的实践中并不可行。如果新药临床定位于治疗NASH相关肝硬化，这类人群更易发生失代偿事件和死亡或肿瘤，这时以全因死亡率或肝脏相关死亡率作为研究终点的可操作性更好，但是，仍可能需要较长的时间。
当理想的反映疾病进展的终点事件作为硬终点在实践中不可行时，在新药研发和审批中往往会选择其他的临床指标来反映药物治疗的临床获益，这些指标称之为“替代终点”。通常，一种新药最终要获得药监部门审批通过，其确证性临床试验中主要研究终点采纳的替代终点需要证明与真正的临床终点事件（硬终点）有明确的关联。也即这些替代终点的改善可以反映患者与疾病发生机制、自然史相关的临床结局明确获益。对治疗NASH的新药而言，替代终点的改善可以反映患者进展为肝硬化、出现失代偿和进展为肝癌的风险显著降低，进而推断出新药降低全因死亡率和肝脏相关死亡率的临床获益。 ▲ 基于组织学的替代终点 肝组织学可以提供NASH患者脂肪变、肝脏炎症、肝纤维化的疾病进展信息，因此，可作为一个有价值的替代终点评估新药治疗的短期临床获益。 目前已知，疾病谱中的NASH增加了进展为肝硬化和肝癌的风险，因此，针对NASH靶向的新药，治疗后NASH出现逆转或缓解，且肝纤维化无恶化的证据，可以作为临床试验的一个替代终点。同样，有证据表明，已伴有进展期肝纤维化/早期肝硬化的NAFLD患者其全因和肝脏相关的死亡风险增加，因此，针对肝纤维化靶向的新药，治疗后出现肝纤维化逆转或缓解，且NASH无恶化的证据，也可以作为临床试验的一个替代终点。这些替代终点在目前多数的NASH临床试验中应用，尽管理论上推测可降低肝脏病变进展的风险，但迄今尚缺乏直接的证据说明NASH患者达到了上述替代终点，其进展为肝硬化、出现失代偿和进展为肝癌的风险确实降低了。这也就说明了，目前临床应用的这些替代终点与发病机制、自然史相关的真正临床终点事件（硬终点）间的关联尚未被阐明。 方案设计中一个挑战性的实际问题在于如何去定义“NASH逆转或缓解”。尽管，NASH的组织学定义仍存有争议，但普遍认为脂肪变、小叶炎症和气球样变是NASH的典型组织学特征。那么，“NASH逆转或缓解”是否意味着这三项重要的组织学特征均消失或均明显改善，这需要达成共识。因为不同的定义评价时新药的有效性会不同，例如，“NASH逆转”定义为这3项重要的组织学特征均完全消失与定义为NAS＜3分（因为根据NAS评分系统，＞5分可诊断NASH，＜3分可排除NASH）。而且，评价时这3项重要的组织学特征是否需要赋予不同的权重，尽管炎症和气球样变被认为与疾病进展关联更大，但至今也未达成共识。同样，“NASH缓解”和“肝纤维化逆转或缓解”在方案中都需要明确的定义，而这些定义也同样需要达成共识，能反映临床结局的真正改善。 尽管并不能真正代表人类NASH的进程，但NAS评分系统由于可定量地评估药物对脂肪变、小叶炎症和气球样变的疗效，是目前NASH临床试验中最常用的评分系统，被用于多数NASH临床试验。但因未将肝纤维化纳入计分系统，而肝纤维化的发生和进展普遍被认为是肝脏病变进展或导致严重不良临床结局的依据。因此，NAS系统有其局限性。多数目前公布的临床试验主要研究终点是“NAS下降≥2分，且肝纤维化无恶化”，这里需要探讨的问题是其真正的临床价值。迄今，“NAS下降≥2分”与疾病进展风险的关联并未阐明，也就是说，即使“NAS下降≥2分”也并不意味着这些患者进展为肝硬化、肝癌的终点事件风险降低。新近提出的SAF系统是否对评价新药的有效性更有价值，也需要在实践中去证明。 基于现状，即使一个新药在确证性的注册临床试验有限的疗程中达到了上述终点，而且其安全性良好，从目前美国食品药品监督管理局和欧盟等药监部门新药审批的态度，可以考虑有条件获得暂时的批准，以满足临床目前的需求，但其真正的获批需要更长期的证据说明新药确实改善了临床结局，进展为肝硬化、出现失代偿和进展为肝癌的终点事件确实降低，进而降低了全因和肝脏相关死亡率。因此，在没有学术界和药监部门公认的更好的替代终点前提下，了解目前NASH领域组织学替代终点局限性的现状，有助于更好地制订新药临床研发策略，在确证性注册临床试验方案设计时，应考虑更长的疗程，以便观察到新药的真正临床获益。 ▲ 基于非创诊断技术的替代终点 近来研究表明，基于MRI的质子密度脂肪分数(MRI-PDFF)可以较控制衰减参数更准确地判断肝脂肪含量。因此，基于MRI的技术被认为是一个较好的工具判断治疗前后肝脂肪变的情况。 此外，有大量研究致力于用无创的方法诊断或评估NASH和肝纤维化，并取得一定进展。这些生物标记或组合中的血清生物标志物包括生化、氧应激、炎症、凋亡和纤维化的诸多指标，如NAFLD肝纤维化评分、FIB-4 指数和BARD评分等预测模型，或反映炎症的血清细胞角蛋白18，或反映肝纤维化的FibroTest、ELF 或Pro-C3 等。一些基于影像学技术的方法也被报道具有较好的判断效果，如磁共振弹性成像、瞬时弹性成像等用于肝纤维化的判断。但目前所有用于诊断或评估NASH和肝纤维化的无创技术均无法代替金标准组织学，也未发现与NASH发病机制相关的特异性诊断生物标志物。因此，这些替代终点无法用于确证性临床试验中来判断新药的疗效。 ▲ 针对肝硬化的替代终点 在针对NASH相关肝硬化的临床试验中，一些替代终点被认为可预测肝硬化患者的死亡风险，如 Child Pugh Turcotte评分、终末期肝病模型评分和肝静脉压力梯度。但肝静脉压力梯度是有创的手段，在国内也未广泛开展，这制约了临床试验实施层面的开展。 ▲ 方案设计中替代终点的选择 在临床研发早期的探索性临床试验（Ⅱa期）阶段，应根据不同的探索目的（Proof of Concept、剂量探索、疗程探索、最佳合适人群探索等）设定相应替代终点，主要研究终点可以考虑应用基于组织学的替代终点，也可以考虑基于无创诊断技术的替代终点。在此阶段，进行新药的充分探索为后续临床试验提供依据是主要目的，替代终点选择的不同决策各有其利弊。如选择以基于组织学的替代终点作为主要研究终点，其好处是可以为后续的确证性临床试验提供组织学有效性的直接证据，以利于做出正确的停止或继续研发决策，如在此阶段已显示出明显的疗效，这将会大大增加确证性试验的成功率，反之，应谨慎地评估是否继续研发的决策；其缺点是此阶段的研发周期较长、成本较高。如选择以基于无创诊断技术的替代终点作为主要研究终点，其好处是此阶段的研发周期较短、成本较低，如在此阶段显示无效，可以快速做出终止研发的决策；其缺点是即使此阶段显示有效，但由于无法提供新药在组织学有效性的直接证据，会大大增加确证性试验的失败风险。 在临床研发的较后期阶段（Ⅱb或Ⅲ期），尤其是决定注册是否成功的Ⅲ期确证性临床试验阶段，应该以基于组织学的替代终点作为主要研究终点，直到有学术界和药监部门公认的更好的替代终点被发现。需提醒的是，尽管是以基于组织学的替代终点作为主要研究终点，但在方案的具体设定时，应该考虑新药的作用靶点，其效应应与新药的作用机制相符合。如新药主要的作用靶点是针对NASH发病机制的，应以逆转或缓解NASH作为首要的目标；如新药主要的作用靶点针对肝纤维化，应以逆转或缓解肝纤维化作为首要的目标。近来，有专家认为，即使针对NASH靶向的新药，也应以肝纤维化是否逆转或缓解作为评估新药是否有效的重要考量。
新药的安全性和疗效同样重要，因此，在NASH新药的临床试验中应设定相应指标以评估其安全性。安全性指标设定原则与其他新药的临床试验一样：（1）临床试验中常规的安全性指标设定；（2）结合临床前毒理学研究中发现的新药潜在毒性或毒性靶器官，设定相应特定指标以评估其安全性；（3）结合在早期人体学临床试验中发现的安全性信息，设定相应特定指标以评估其安全性；（4）结合同类新药已报道的安全性信息，设定相应特定指标以评估其安全性。 此外，现有证据表明，NASH在其肝脏疾病进展的自然史中，往往与糖尿病、肥胖等MS并存，并且与心脑血管事件风险和肿瘤发生的风险相关。因此，针对NASH的治疗不能以增加肝外并发症风险为代价，为此，需要在确证性临床试验中设定相应安全性指标来专门评估对心脑血管事件风险、糖尿病等代谢风险的影响。由于肿瘤的发生通常需要较长时间，在疗程有限的确证性临床试验阶段很难进行评估，上市后的Ⅳ期临床试验中进行评估是一个可行的方法。 尽管具有挑战，NASH治疗药物的肝脏毒性评估仍然重要。因为，一个治疗肝脏疾病的新药，如其本身可能会导致潜在严重的肝毒性，是不会被接受的。为此，方案设计中应该设定相应观察指标，同时建立临床试验中NASH背景患者的药物性肝损伤的可行性诊断标准，只有这样，新药的肝毒性才能被客观地评估。
NASH临床试验中的混杂因素是非常复杂的，至少包括：NASH患者的饮酒行为有无；伴随的MS组分及其针对MS的复杂的合并药物治疗；其他肝外并发症情况及干预；生活方式干预与否；生活方式干预的执行等。所有这些因素都可能对研究结果产生影响，如何尽可能控制这些混杂因素，应在方案设计和实施中予以重点关注。此外，如何提高NASH患者的依从性也是重要的课题，这在临床实践中是令人担忧的问题。 4 小结 总之，不同研发阶段的临床试验目的并不相同，良好的设计需多角度综合考虑诸多问题：就药物研发的角度需考虑研发策略、临床前研究和前期临床研究提供的依据等；就疾病的角度需考虑NASH的流行病学、自然史、当前可行的诊断和临床评估方法、治疗手段等；就临床试验的方法学角度需考虑统计学的假设是什么、是否及如何随机、如何选择对照、样本量的确定、主要研究终点的选择等。一个兼顾科学和伦理学原则，具有较强可操作性的临床试验方案，是科学、客观评价新药有效性和安全性的基础。 引证本文：茅益民. 非酒精性脂肪性肝炎新药探索性和确证性临床试验方案设计中需重点关注的问题[J]. 临床肝胆病杂志, 2018, 34(12): 2509-2514. |
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