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基于HPLC-MS/MS技术鉴定和定量酰基-辅酶A介导的蛋白酰化酶解产物

2019-12-15  42ZB432

    最近发现由酰基-辅酶A(Acyl-CoA)介导的酰化反应(见图1)可能是表观遗传过程中的一种新调节机制。另外,酰化反应也与细胞代谢和细胞信号转导等生理过程密切相关。随着质谱技术的发展,越来越多的研究证明蛋白质上的赖氨酸残基会发生酰化反应,得到系列蛋白赖氨酸酰化产物。这类酰化反应是近些年新发现的一种蛋白质翻译后修饰类型,而针对蛋白酰化反应,现有的分析方法如蛋白免疫印迹法(Western blotting)和蛋白质组学等尚未能同时分析多种蛋白酰化产物,无法进行绝对定量分析。该研究中,作者通过组合酶水解法将蛋白水解为单个氨基酸残基,接下来建立HPLC-MS/MS方法同时鉴定和定量了小鼠肝脏、肾脏、心脏和脑组织中14种蛋白质酰化酶解产物,检测水平在nmol/L水平,其中还包括了4种新鉴定的酰化赖氨酸结构(乙酰乙酰化、异戊酰化、2-甲基丁酰化和甲基巴豆酰化等)。

图1 酰基-辅酶A介导的蛋白酰化反应原理

    作者首先收集3至4个月大的C57BL/6J小鼠的肝脏、肾脏、心脏和脑组织并在液氮中速冻,再将冷冻器官转移至蛋白裂解专用EP管中,加入含蛋白酶抑制剂(无EDTA)的PBS溶液进行样品匀浆。离心后将上清液转移至EP管中,加入裂解缓冲液(含4%SDS、100 mM HEPES和20 mM DTT,pH 8.0),使用超声波破碎仪对样品进行高功率超声10个循环,快速离心样品,将样品离心后的上清液转移至EP管中,在-20℃下加入4倍体积的冰丙酮过夜沉淀蛋白,4°C下离心30 min,然后将沉淀用4°C的80%丙酮水溶液(v/v)洗涤两次,氮气吹干,沉淀样品使用PBS溶液进行样品复溶。

    接下来,作者将上述复溶样品分别进行酶水解和酸水解处理,首先使用组合酶切法对复溶样品进行酶切,加入0.3单位的链霉蛋白酶E(ProE)孵育48 h,ProE中包含来源于灰色链霉菌(Streptomyces griseus)的肽链内切酶(endopeptidases)和外切酶(exopeptidases),其中肽链内切酶可以使蛋白结构更适于外切酶的酶切作用,外切酶将蛋白酶切为多肽片段。接下来加入0.1单位的羧肽酶(carboxypeptidase Y)和0.5单位的氨基肽酶(aminopeptidase)孵育24 h,即可进一步将多肽片段酶解为单个氨基酸残基;酸水解采用强酸(盐酸)进行水解,可保证蛋白完全水解为氨基酸。将酸水解效率规定为100%,用水解产物中亮氨酸的量来表示酶水解的效率。采用亮氨酸标准品配制标准曲线工作溶液,通过茚三酮反应,用分光光度计在546nm波长下测定各组织酶水解和酸水解样本的吸光度,带入亮氨酸标准曲线计算各样本中的亮氨酸浓度,以酶水解和酸水解测定的亮氨酸浓度比计算得到各组织样本的酶水解效率。肝、肾、心脏和脑组织的氨基酸平均酶切效率分别为86%、85%、88%和88%等。

    基于质谱裂解规律和标准品对酰化氨基酸进行鉴定,最终鉴定得到14种酰化赖氨酸,图2为2-甲基丁酰赖氨酸的二级质谱信息。进一步建立HPLC–MS/MS方法对酶水解样品进行分析,质谱系统为AB公司的API4000液质联用仪,色谱柱为Waters XSelect HSS T3(250×3.0mm,5μm)色谱柱,流速0.7mL/min,柱温为25℃。流动相:A=水,B=70%甲醇水溶液(v/v),均添加了七氟丁酸作为流动相添加剂,梯度洗脱。采用多反应监测模式测定,质谱的优化参数见表1,分析物的EIC提取色谱图见图3,小鼠各组织器官匀浆液中的酰化赖氨酸含量见表2.

图2 2-甲基丁酰赖氨酸的二级质谱信息

A:标准品:B,肝组织匀浆酶解样品

表1 14种酰化氨基酸标准品质谱参数

图3 14种酰化氨基酸的EIC提取色谱图

表2 小鼠各组织匀浆液中的酰化赖氨酸含量

    该研究未在蛋白水平研究活性酰基-辅酶A介导的蛋白酰基化后修饰,而是对水解得到的酰化赖氨酸进行了表征,作者开发了用于分析生物样品中酰化赖氨酸的HPLC-MS/MS分析方法,总共在小鼠肝、肾、心脏和脑组织中匀浆中鉴定和定量了14种酰化赖氨酸,其中包括了4种新鉴定的酰化赖氨酸结构(乙酰乙酰化、异戊酰化、2-甲基丁酰化和甲基巴豆酰化等),为研究蛋白酰基化后修饰反应提供一定基础。

参考文献

Tim Baldensperger, Simone Di Sanzo , Alessandro Ori, Marcus A. Glomb*. Quantitation of Reactive Acyl-CoA Species Mediated Protein Acylation by HPLC–MS/MS, Anal Chem. 2019, 91, 19, 12336-12343.

文献整理:李元元;编辑:生宁、张金兰;第155期

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