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导语：微卫星，又被称作短串联重复序列（STR），重复单元一般为1-6个核苷酸构成。若肿瘤细胞中微卫星的重复单元数目较正常细胞发生了变化，则为微卫星不稳定（MSI）。MSI对于肿瘤的诊断、预后判断和治疗方案的选择均具有重要的临床价值，基于此，众多官方指南和共识纷纷强调MSI检测的重要性。 在人类基因组中，微卫星的数量庞大，因此，筛选具有高灵敏度和高特异性的少量位点以用于临床实践是更加可取的办法。再者，不同人种之间的MSI发生率是有所差异的，因此，国内的研究者开始探索不同的检测Panel在东亚裔人群中的灵敏度和特异性。今天特别邀请到郗彦凤教授向我们介绍MSI在肿瘤诊疗中的作用、诊断方法、微卫星位点筛选的重要性和我们中国人群中的MSI研究进展。 专家介绍 郗彦凤 博士，主任医师，博士生导师，山西省肿瘤医院病理科主任。 中华医学会病理分会分子病理学组和 头颈病理学组委员 中国抗癌协会肿瘤病理学分会常务委员 中国医师协会病理医师分会委员 山西省医学会病理分会主任委员 山西省医师协会病理分会会长 山西省卫健委病理质控中心主任 山西省卫计委高端领军人才 山西省学术技术带头人 三晋英才支持计划拔尖骨干人才 MSI检测能够对肿瘤患者带来哪些获益？ 诊断方法有哪些？ MSI是一个“历史悠久”的Biomarker，从上个世纪90年代开始，多项研究证明MSI在结直肠癌的诊断、治疗和预后都具有重要价值。近年来，MSI再一次成为临床关注的热点，这得益于免疫治疗的兴起。目前，MSI的临床价值体现在多个方面： 1.辅助筛查林奇综合征：所有结直肠癌患者应采用MSI或MMR蛋白检测进行林奇综合征的筛查； 2.判断预后：MSI-H型的患者临床进展缓慢，预后较好； 3.指导5-FU辅助化疗：II期的MSI-H型结直肠癌患者无法从5-FU化疗中获益； 4.指导免疫治疗：MSI-H或dMMR型的肿瘤患者在多个实体瘤中被证实免疫治疗疗效显著。 MSI的现象主要是由于DNA错配修复系统（MMR）蛋白功能缺失或异常所导致的，所以可以通过免疫组化（IHC）检测MMR蛋白去评估MSI的状态。目前，国际公认的MSI检测的“金标准”方法是PCR+毛细管电泳法，其中常用的是美国国家癌症中心（NCI）推荐的“2B3D” NCI Panel和Promega Panel。“2B3D” Panel包含2个单核苷酸位点（BAT-25，BAT-26）和3个双核苷酸位点（D2S123, D5S346 和 D17S250），而美国Promega采用5个单核苷酸位点（BAT-25，BAT-26，NR-21，NR-24和MONO-27）。另外，随着高通量测序（NGS）的发展，它也逐渐被用于MSI的检测中。 MSI检测需要选择经过验证的MSI位点的重要原因 1.MSI发生率存在人种差异 多项研究显示，MSI发生率在人种之间存在差异，白种人中MSI-H型结直肠癌占比为8-20%，埃及结直肠癌患者MSI-H型占比为37%，非裔美国人的MSI-H型结直肠癌患者占20-45%，而中国结直肠癌患者中MSI-H型占4.5%-25.3%。此外，有研究显示，单核苷酸位点存在人种差异，东亚裔人群在单核苷酸位点存在一定的多态性。因此，选择出在中国人群中灵敏度较高的微卫星位点显得非常重要。 2.检测位点差异可能导致假阴性 在人类基因组中，目前已知的微卫星已经超过1900万个，当然我们没有必要去检测所有的微卫星，而是需要选择少量微卫星位点。由于每个微卫星位点的突变阳性率是有差异的，所以，不同微卫星所构成的Panel的灵敏度和特异性也随之不同，因此，微卫星位点的选择显得尤其重要。如NCI于1997年在微卫星不稳定的专题会议中公布的“2B3D” NCI Panel，它包含的5个微卫星位点是通过国外多个实验室对上百个微卫星位点进行评估验证后筛选而来的，那么，这些验证工作证实了这5个微卫星位点在结直肠癌中具有较高的突变频率，进而保证“2B3D” NCI Panel能够真实准确的反映MSI的状态。如果MSI Panel中纳入一些突变频率较低的微卫星位点，可能会降低MSI检测的灵敏度而造成漏检。因此，检测位点的差异可能会导致假阴性的结果进而耽误患者的诊疗。 MSI检测中国人群的16项研究结果汇总 从本世纪初开始，国内陆续在结直肠癌中开展了一些MSI的相关研究（表 1）。 彭俊玲等采用IHC和“金标准”方法的“2B3D” Panel同时对75例散发性结直肠癌样本进行分析，PCR结果显示MSI-H 19例、MSI-L 2例，其他54例(72%)为MSS，IHC结果为dMMR 16例(21.33%)，pMMR 59例(78.67%)。MSI-H好发于年龄>50岁、肿瘤无远处转移、MMR蛋白缺失人群，且类型以黏液腺癌为主，因此MSI-H的散发性结直肠癌转移风险较低、预后较好。 杨柏林等采用“金标准”方法的“2B3D” Panel检测105例散发性结直肠癌患者的MSI状态。其中MSI-H 14例 (13.3% )，MSI-L 12例 (11.4% )，MSS例 (75.3%)。MSI-H患者的中位DFS为21个月，明显长于MSS的11个月及MSI-L的13个月。 肖秀英等在73例散发性结直肠癌中进行了BAT-25和BAT-26的分析，MSI的阳性率为15.1%，与患者的性别、肿瘤发生部位、分化程度和预后有关。 从多项研究中可以看出，研究者们多采用PCR+毛细管电泳和IHC的方法对结直肠癌MSI进行分析，这些研究与国外的研究得到了一致的结果，中国人群中MSI-H型的结直肠癌患者具有独特的临床病理特征且预后相对较好。 表 1: 东亚裔人群MSI相关研究的数据汇总 MSI检测——中国位点验证性研究 表 2：“2B3D” Panel, Promega Panel和24-位点 Panel的一致性分析（IHC作为参照） 国内一项于2019年发表在《Cancer Medicine》的多中心研究首次在中国人群中对MSI微卫星位点的筛选进行了分析，同时比较了“金标准”方法中多个MSI检测Panel在中国人群中的结果，然后根据免疫组织化学（IHC）染色结果进行一致性分析。该研究中总共收集了271例结直肠癌的病理组织标本，除了采用“2B3D”和Promega Panel对MSI状态进行了评估以外，还纳入了一个24个微卫星位点的Panel。研究结果显示，三个检测Panel中，“2B3D” Panel和IHC染色结果之间的一致性最高，Kappa值为0.850（表 2）。 而这三个不同的Panel特异性相当，均在95%以上，但灵敏度差异较大。“2B3D”、Promega和24个位点的Panel的灵敏度分别为87.18%、77.78%和56.41%（表 3）。 表 3：2B3D Panel, Promega Panel和24-位点 Panel的灵敏度和特异性 在此研究中，根据单个微卫星位点分析显示，灵敏度最高的两个微卫星位点均为单核苷酸位点，即BAT-26（95.45％）和BAT-25（86.36％）。因此，研究者推测BAT-25和BAT-26的变异是最常见且最早的事件，目前常用的“2B3D”和Promega Panel均包含这两个位点。 另外，随着检测位点的增加，24个位点的Panel检测灵敏度仅为56.41％（表 3），且与IHC的一致性低，Kappa值为0.675（表 2）。考虑到MSI的形成是一个累积过程，且每个微卫星位点突变的频率和发生的顺序都存在差异，若检测Panel中包含过多的突变发生在肿瘤晚期或突变频率相对较低的微卫星位点，可能会导致MSI检测灵敏度降低，因此盲目的增加微卫星数量可能反而会降低结果的可信度。 综上，“2B3D” Panel在东亚裔人群中灵敏度最高，另一项的中国人群的研究也得到了相同的结果。而国外的研究普遍认为Promega Panel具有更高的灵敏度和特异性，究其原因可能是人群差异所造成的。 总结 微卫星不稳定已经成为肿瘤诊疗中重要的生物标志物之一。国内外官方公布的指南和共识纷纷强调MSI检测在肿瘤诊疗中的重要性，并推荐了基于“金标准”方法的“2B3D”和Promega两个MSI Panel，建议参考，并且这两个Panel已经在中国人群中经过了临床数据验证。如果考虑采用其他检测Panel，需要注意每个微卫星位点的突变频率是有所不同的，这很有可能会影响到最终MSI评估的准确性，因此，为了避免造成假阴性的结果，需要临床数据对其进行验证。最后，希望能够通过更精准的MSI检测，在肿瘤诊断、预后和治疗选择中帮助到国内广大的癌症患者。 参考文献： 1.林武华 et al.,散发性结直肠癌微卫生不稳定性与hMSH3和hMSH6基因突变的研究.武警医学,2001.12(7):p.392. 2.程蕾et al.,结直肠腺瘤中的微卫星不稳定性类型. 3.李欣et al.,具有家背景大肠癌微卫星不稳定性研究. 中国医科大学学报, 2008.37(3):p.408-410. 4.肖秀英et al.,散发性结直肠癌中微卫星不稳定性及临床病理意义.中华肿瘤杂志，2006. 28（4）：p.289-293.中国生物化学与分子生物学报,2003.19(6):p.799-806. 5.Buhard et al., Multipopulation Analysis of Polymorphisms in Five Mononucleotide Repeats Used to Determine the Microsatellite Instability Status of Human Tumors.J Clin Oncol 24(2)p:241-251. 6.金黑鹰et al.,多重荧光 PCR方法对结直肠癌进行微卫星不稳定检测及其临床价值.中华胃肠外科杂志, 2007.10(3):p.217-220. 7.杨柏林et al., 散发性结直肠癌微卫星不稳定性及其与临床病理生物学的关系. 世界华人消化杂志, 2007. 15(10): p. 1160-1164. 8.Peng et al.,Clinicopathological Features of Non-familial Colorectal Cancer with High-frequency Microsatellite Instability. 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