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上一讲呢，本侠给大家介绍了大名鼎鼎的PCR，这一讲开始本侠将要给大家介绍另一项同样大名鼎鼎的实验技术，那就是WesternBlotting（蛋白质印迹法，后面简称WB）。 上回说PCR的时候，本侠说过，PCR是用来检测某分子在基因水平的表达情况的，当时本侠还说到了，在一般情况下，我们还需要同时检测该分子在蛋白水平的表达。今天本侠要讲的WB就是用来检测蛋白表达的最常用方法，当然喽，之一。 WB的基本原理 如果我们想知道细胞里面有没有表达某种蛋白，用眼睛看，看不到；用耳朵听，听不到；用手摸，也没法儿摸……桑脑筋！！！没关系，你没办法触及蛋白，有一种东西可以，那就是抗体！所以WB 检测蛋白的过程说白了就是利用抗体识别蛋白的过程，这就是WB的原理基础。不仅如此，这也是免疫组织化学（多数情况下）以及流式细胞术（也是多数情况下）的原理基础。 具体来说，WB是将细胞中的大量蛋白分离后，先利用一种载体（如一张膜）抓住蛋白，然后用能与该蛋白特异结合的抗体识别蛋白（这种特性性抗体我们习惯叫做“一抗”，不带任何标记，即抗体上没有酶也没有荧光），接着再用带有标记的抗体（我们习惯叫“二抗”）识别一抗。这样一来，三个小盆友手拉手，蛋白拉着一抗，一抗拉着二抗，所以如果我们有办法检测到二抗，就意味着我们能检测到蛋白了。童鞋们别忘了刚刚本侠说过，二抗是带有标记的，这个标记就是用来让蛋白“现形”的法宝。WB中的二抗所带的标记叫做辣根过氧化物酶（HRP），让蛋白“现形”的时候，只要将HRP的底物与HRP进行反应即可。 WB的操作步骤 那么WB究竟如何具体操作呢？总的来说，分为五步：蛋白提取、蛋白电泳、转膜、抗体孵育、显色。具体点地说就是先从组织/细胞中将总蛋白（我们要检测的蛋白就在其中）提取出来，然后通过电泳的方法将总蛋白按分子量的大小进行分离（以便抗体识别蛋白），接着把分离好的蛋白从上步电泳中的胶上转移到便于抗体识别蛋白的载体上，这个载体就是一种薄膜。一旦蛋白转移到膜上，就可以用抗体识别蛋白了，所以后面的过程就是用一抗识别（结合）蛋白，再用HRP标记的二抗识别（结合）一抗，最后用HRP的底物与二抗上的HRP反应，让蛋白“现形”。 好了，如何做WB，请待本侠一步一步慢慢道来。 第一步：蛋白提取（关键，且做好不容易） 我们要检测的蛋白不是在细胞膜上就是在细胞里面（如果有特殊要求，需要明确蛋白究竟是在细胞质中还是在细胞核中，还需涉及胞浆蛋白和胞核蛋白的提取，但是咱们这一讲只说最简单的情况，就是总蛋白的提取），所以我们提取蛋白第一步需要做的就是瓦解细胞膜，让蛋白释放出来。瓦解细胞膜常用的是一种叫做RIPA的裂解液，可以自己配，也可以买现成的，效果差不多，就看你更愿意花钱还是更愿意花时间。裂解细胞最关键的（本侠多年的经验）有两点：1、裂解的手法；2、裂解液的用量，本侠在接下来的讲解中会着重提到这两点。 裂解细胞之前先将细胞洗干净。因为在培养细胞的过程中，我们会用到血清，血清里面有各种各样的蛋白，而我们要测的就是蛋白质（但是是细胞里的，而不是血清里的），所以为了避免干扰，我们需要先用PBS将细胞洗两遍。洗细胞这一步操作对于贴壁细胞，可以选择在收集细胞之前做，也可以选择在收集了细胞以后再做（两者主要区别在于后者会把原本漂浮在培养基中的死细胞也收集进来，请童鞋们按需选择），但是对于悬浮细胞来说就没得选了，只能先收集细胞再洗。如果是收集细胞之前洗的话，就先将原来的培养基弃去，接着加适量的PBS（童鞋们自己看着加，量多量少无所谓的，只要能起到洗的作用就行），摇动培养瓶/皿让PBS充分接触细胞将细胞洗干净，然后弃去PBS，换新的PBS再洗一次（患有强迫症的童鞋们可以多洗几次，没关系的，不然洗的次数少了可能会伤身）。洗完细胞以后再加1-2mlPBS，找个刮铲把细胞刮下来，然后把细胞收集到离心管里离心即可。如果是收集之后再洗的话，就先用刮铲把细胞刮下来收集到离心管里离心（悬浮细胞直接收集，不用刮），弃上清后加PBS重悬（洗细胞），再次离心，弃上清后用PBS再洗一遍就好了。 “刮” 细胞 请童鞋们注意，这里有一个关键点，决定着后续裂解效果的，那就是在最后一次离心以后，弃上清请不要弃得一干二净，留10-15ul，用来在裂解之前把细胞重悬起来。请待本侠稍稍解释为什么要这么做。洗完细胞下一步我们是要加裂解液将细胞裂解的，如果我们事先没有用PBS先将离心后的细胞团块冲散，而是直接将裂解液加到离心完的那团细胞上，那么裂解液会很快将最外围的细胞裂解，裂解后形成的粘液会像一层膜一样将内层还未被裂解的细胞包裹起来，使得内层的细胞很难有机会再接触到裂解液，直接影响提取到的总蛋白的量，这也是为什么有些市售的裂解液使用说明中建议，用PBS洗完贴壁细胞细胞以后，不用收细胞，直接在培养瓶/皿中加入裂解液的原因，因为这样可以让每一个细胞都接触到裂解液。不过这样一来加入的裂解液量就太大了，直接导致最后提取到的总蛋白浓度太低，最终会影响总蛋白的上样量，这会导致一些表达量很低的蛋白很难被检测到。所以本侠的经验是，PBS洗完细胞以后，离心收集细胞，再用少量PBS将细胞重悬起来，涡旋仪涡旋打散细胞，迅速加裂解液（一般几十微升即可）。这样做就可以在保证裂解效果的同时提高总蛋白的浓度。加好裂解液再迅速涡旋几秒钟，冰上静置20分钟（强迫症童鞋可多放十几分钟，没什么太大的影响），12000rpm离心，离心后请童鞋们千万注意，留留留上清，白色沉淀是要扔掉的，不要扔错东西了呀，蛋白溶在上清里呢。 总蛋白提取到以后童鞋们记得做个蛋白定量，这是为了将来方便比较不同组之间同种蛋白的表达差异的。童鞋们可以想一想，如果我们想要比较A和B两种不同处理对细胞中P蛋白表达的影响，那我们必须比较A和B处理以后等量的总蛋白里P蛋白表达是不是不同才有意义，不然P蛋白的表达差异完全可以是上了不等量的样本造成的。关于蛋白定量，市面上有很多种试剂盒，童鞋们挑一个知名度好一点的牌子就可以了，过程很简单，出结果也很快，只是定量前需要先找好蛋白定量是需要的仪器——酶标仪。 酶标仪 WB第一步蛋白提取本侠就说这么多，下一讲呢本侠将要给大家说说第二步蛋白电泳，俗称“跑胶”。  猪猪侠小贴士 1、满足一下童鞋们的好奇心，这个世界上除了有一种检测蛋白的技术叫做Western以外，还有一种检测RNA的技术叫做Northern，并且还有一种检测DNA的技术叫做Southern，额。。。还有一种同样是检测蛋白的技术叫做Eastern，呵呵哒，东南西北全活了。 2、好奇的童鞋一定还会问，为什么不让特异性抗体（一抗）直接带标记呢，那样不是更省事咩？本侠在这儿呢说说自己的理解。一般一个一抗可以和多个二抗结合，这样就可以起到一种放大信号的作用，这会大大提高检测成功率。另外，一抗（前面说过一抗是一种特异性抗体）的制备比较困难（说白了就是会卖得很贵），我们当然希望在获得一种一抗以后能让它多发挥一些作用，所以细心的童鞋们会发现，一抗的说明书上往往会标明这种一抗的各种用途，比如某种一抗除了可以用于Western以外，可能还可以用于免疫组化、流式等等。但是，每种应用所要求的标记很可能是不一样的，也就是说如果把一抗加上适合Western检测的标记，那这种一抗多半就不能再用于流式检测了，因为流式检测要求抗体是荧光标记的。 3、如果有童鞋愿意自己配RIPA裂解液，可以尝试一下本侠推荐的配方：1M、PH8.0的Tris-HCl，2.5ml；4M的NaCl，3.125ml；10%的NP-40，1ml；0.5M、PH8.0的EDTA，0.5ml；1M的DTT，50ul；甘油，2.5ml；加水定容至50ml。裂解液使用前需要加入一种防止蛋白降解的秘密武器，就是蛋白酶抑制剂。蛋白酶抑制剂现在满大街都有的卖，而且不像以前那么贵了，童鞋们可以买现成的用。 4、细胞收集后、裂解前要用少量PBS重悬，这个少量的PBS可以少到只有10ul。请童鞋们不用怀疑，10ul是可以把离心完的细胞团块打散的，你要做的是把枪头捅进细胞团块里面再进行吹打。 5、关于裂解液的用量，本侠的经验是5×107以内的淋巴细胞（个头较小）用30-40 ul裂解是没有问题的。如果童鞋们用的是肿瘤细胞（个头很大），可以适当增加裂解液的体积，当然做个梯度摸个条件是最好了。不过，如果童鞋们检测的目的蛋白表达量很高的话，那裂解液的用量当然可以任性一些。 6、加完裂解液冰上静置后离心，离心时有个小窍门，本侠忍不住要跟童鞋们分享。我们离心的时候用的一般是1.5ml或2ml的EP管，管盖的一边有个小突起，本侠的习惯是将所有EP管的小突起都朝一个方向放置，这样离心下来的沉淀也会在一个固定的位置。这样有一个好处，就是即使在沉淀很少的情况下，也能很快辨别沉淀所在的位置，便于吸取上清。这个窍门在其它需要离心的场合同样适用。 7、本侠在文中说蛋白定量用试剂盒来做，但是事实证明，有不少小伙伴是定量克星，怎么定都不准。这时候本侠建议，干脆就不要用试剂盒了，收样本的时候每组计数同样的细胞用来提取总蛋白，也是一种比较实用的定量方法。 |
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